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灭菌方法的设计
摘要：
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等。可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌，空气则采用过滤除菌。
关键词：灭菌 方法 技术
在医学中微生物的杀灭叫灭菌；灭菌的结果是无菌，也就是说指定样品经过一系列处理后不含任何微生物。例如手术器械的消毒过程等。微生物的灭菌如果用加热方法与温度有关外还和作用时间有关。100度温度下加热30分左右时候基本上大部分微生物会被杀灭，但是细菌的芽孢却例外，能耐高温。
在医学实践中，常采用物理、化学及生物的方法，清除环境中的微生物，以切断传播途径，保护易感人群，从而控制或消灭传染病。现将有关术语介绍如下：
消毒 (disinfection) 杀灭物体上病原微生物的方法，称为消毒。用于消毒的化学药品称消毒剂。常用浓度下的消毒剂，只对细菌繁殖体有效，对其芽胞则需提高消毒剂浓度和延长作用时间才能杀灭。
灭菌 (sterilization) 杀灭物体上所有微生物，包括细菌芽胞的方法，称灭菌。
无菌 (asepsis) 物体中无活的微生物存在，称为无菌。防止微生物进入机体或物体的方法，称为无菌操作或无菌技术。进行微生物学实验、外科手术、换药、注射时，均需严格遵守无菌操作规定。
防腐 (antisepsis) 防止或抑制微生物在物体中生长繁殖的方法，称防腐。用于防腐的化学药品称防腐剂。使用同一种化学药品低浓度时为防腐剂，高浓度则为消毒剂。
卫生清理 (sanitation) 将微生物污染了的无生命物体表面还原为安全水平的处理过程。例如医院内的病房、病人使用过的用具布类的卫生处理等。
一、物理消毒灭菌法
物理消毒灭菌法是医学实践中常用的方法，通常包括热力、紫外线、辐射、超声波和滤过除菌等。
(一)热力灭菌法
热灭菌法 利用高温使微生物细胞内的一切蛋白质变性，酶活性消失，致使细胞死亡。通常有干热、湿热和间歇加热灭菌等法。
热力能破坏微生物的蛋白质和核酸，使蛋白质变性凝固，核酸解链崩裂，从而导致其死亡。
1.干热灭菌法 直接利用火焰将微生物烧死（如烧接种环、载玻片和试管口等）。不能用火焰灭菌的物品则利用热空气灭菌,将物品放在烘箱中加热到160～170℃,持续90分钟，此法适用于玻璃、金属和木质的器皿。
(1)焚烧与烧灼 焚烧仅用于废弃的被病原微生物污染的物品、垃圾、人及动物尸体等。烧灼用于微生物实验室的接种环、金属器械、试管口、瓶口等的灭菌。
(2)干烤 使用干烤箱灭菌，一般需加热至160℃～170℃经2h，可达到灭菌的目的。适用于玻璃器皿、瓷器、金属物品等的灭菌。
2.湿热消毒灭菌法
湿热灭菌 以沸水、蒸气和蒸气加压灭菌。巴氏灭菌法就是湿热灭菌，此法有两种方式，①低温长时间处理：在61.7～62.8℃下处理30分钟；②高温短时间处理：在71.6℃或略高温度下处理15分钟。在上述诸法中，以蒸气加压灭菌效果最好，可用常压蒸气灭菌，也可在高压蒸气锅中（一般使用1千克/厘米2）灭菌其蒸气温度可达121℃,能将耐热的芽孢在30分钟内全部杀死。但对某些易被高压破坏的物质，如某些糖或有机含氮化合物，宜在0.6千克/厘米2压力下(110℃)灭菌15～30分钟。
(1)巴氏消毒法 法国学者巴斯德创用而得名。主要以较低温度杀灭病原菌或特定微生物，而使物品中不耐热成分不被破坏。此法有两种：一种方法是加热61.1℃～62.8℃、30min；另一种方法是加热71.7℃、15～30s。现在人们多用后种方法对牛奶进行消毒。
(2)煮沸法 煮沸100℃、5～10min，可杀死细菌繁殖体。芽胞则需要煮沸1～2h。常用于注射器、食具与饮水的消毒。
(3)流通蒸气法 用阿诺Arnold)蒸锅或普通蒸笼，加热100℃、15～30min，可杀灭细菌的繁殖体。若将消毒后的物品放入37℃孵箱培养，使芽胞发育成繁殖体，次日再蒸一次，如此连续三次以上，可达到灭菌效果，这种方法称为间歇灭菌法。常用于不耐高温的物品，如糖类、血清和鸡蛋培养基等的灭菌。
(4)高压蒸气灭菌法 是一种迅速而有效的灭菌方法。使用高压蒸气灭菌器，利用加热产生蒸气，随着蒸气压力不断增加，温度随之升高，通常压力在103.4kPa(相当旧制的15磅/吋 2 或1.05kg/cm 2 )时，器内温度可达121.3℃，维持15～30min，可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。此法常用于一般培养基、生理盐水、手术器械及敷料等耐湿和耐高温物品的灭菌。
(二)紫外线与电离辐射
1.日光与紫外线 日光消毒是最简单、经济的方法，将病人的被褥、衣服、书报等在日光下曝晒数小时，可杀死表面的大部分微生物。日光中杀菌的成份主要是紫外线。紫外线200～300nm时，具有杀菌作用，其中以265～266nm波长的紫外线杀菌力最强。紫外线的杀菌原理，主要是细菌DNA吸收紫外线后，一条链上相邻的两个嘧啶通过共价键结合形成二聚体，从而干扰了DNA的正常碱基配对，导致细菌死亡或变异。紫红外线能透过石英，但不能穿过一般玻璃或薄纸，因此，紫外线只适用于物体表面及空气的消毒。例如手术室、婴儿室、传染病房、无菌制剂室、微生物接种室的空气消毒。
2.电离辐射 X射线、γ射线和阴极射线等电离辐射，有较高的能量与穿透力，因而可产生较强的致死效应。其机制在于产生游离基，破坏DNA。此法常用于大量一次性医用塑料制品的消毒；亦可用于中药成药和食品的消毒，而不破坏其化学成分和营养成分。
(三)超声波
超声波是不被人耳感受的高于 20千周/s的声波。其杀菌机制主要是它通过水时发生空化作用，而破坏了细菌细胞质的胶体状体，使其胞膜、胞质分离，胞壁及胞膜破碎致细菌繁殖体死亡。此法主要用于粉碎细胞，以提取细胞组分或制备抗原等。
(四)微波
是一种波长为 1mm到1m左右的电磁波，称微波。它能穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。目前用于消毒的微波有2,450MHz与915MHz两种，常用于检验室用品、非金属器械、无菌病室的食品用具及其它用品的消毒。
(五)滤过除菌
滤过除菌是用滤菌器阻留过滤液体和气体的细菌，以达到无菌的目的。滤菌器含有微细小孔，只允许液体或气体通过，而大于孔径的细菌等颗粒不能通过。常用滤菌器有蔡氏滤器、玻璃滤器、薄膜滤器及高效颗粒空气滤器四种。主要用于不耐热的血清、抗毒素、生物药品以及空气等的除菌。
二、化学消毒法
许多化学药物都有抑制或杀灭微生物作用，按作用不同分为化学消毒剂和化学治疗剂两类，用于消毒、防腐和治疗疾病。
(一)常用消毒剂的种类和应用
具有杀死微生物的化学药物称消毒剂。消毒剂对人体有毒性作用，只能外用，不能内服。主要用于皮肤粘膜的伤口、器械、排泄物和周围环境的消毒。消毒剂在低浓度时也可作防腐用，但防腐剂的关键是应要对人体无毒性作用。消毒剂种类浓度与用途见表 13-1。
常用消毒剂的种类浓度与用途
类别
名称
浓度
用途
重金属盐类
红汞
2%
皮肤粘膜的小创伤消毒
非金属
升汞
0.05%～0.1%
器皿浸泡消毒
硝酸银
1%
新生儿滴眼防淋球菌感染
氧化剂
高锰酸钾
0.1%
皮肤粘膜消毒
过氧化氢
3%
皮肤粘膜创口消毒
过氧乙酸
0.2%～0.5%
塑料、玻璃器材消毒
碘酒
2.0%～2.5%
皮肤消毒
氯
0.2ppm～0.5ppm
饮水及游泳池消毒
漂白粉
10%～20%
地面、厕所与排泄物消毒
醇类
乙醇
70%～75%
皮肤、体温表消毒
酚类
石碳酸
3%～5%
地面、器具表面的消毒

来苏
2%
皮肤消毒
醛类
甲醛
10%
物品表面、空气消毒
戊二醛
2%
精密仪器、内窥镜消毒
表面活性剂
新洁尔灭
0.05%～0.1%
皮肤粘膜、器械消毒
杜灭芬
0.05%～0.1%
皮肤创伤冲洗、金属器械、塑料、橡皮类消毒
染料
龙胆紫
2%～4%
浅表创伤消毒
酸碱类
醋酸
500mml/100m 3
加等量水蒸发 空气消毒
食醋
2%溶液3～5ml/m 3
熏蒸消毒空气

生石灰
加水 1：4或 1：8

配成糊状排泄物及地面消毒

(二)常用消毒剂的杀菌机制
消毒剂杀菌原理一般有以下三方面：
1.使菌体蛋白质变性或凝固 例如醇类、醛类、酸碱类以及高浓度的重金属盐和酚类。
2.干扰细菌的酶代谢系统 例如低浓度重金属盐、氧化剂与细菌胞浆中某些酶的-SH基结合，使酶活性丧失。
3.损伤细菌细胞膜 例如表面活性剂、脂溶剂、低浓度酚类等。
(三)影响消毒灭菌效果的因素
消毒灭菌效果受微生物种类、消毒剂及环境等多种因素影响。
1.消毒剂的性质、浓度与作用时间 同一种消毒剂的浓度愈高，作用时间愈长，杀菌效果愈好。但乙醇以70%左右的消毒效果最好。其原因是更高浓度的乙醇使菌体表面蛋白迅速脱水凝固，影响乙醇渗入菌体内。
2.细菌种类 同一消毒剂对不同细菌的杀菌效果不一样，是因为不同细菌对消毒剂抵抗力不同。细菌的幼龄菌对消毒剂比较敏感。
3.有机物及其他因素 细菌常混合在血清、脓、痰、排泄物中，这些物质中的有机物可阻碍消毒剂与细菌的接触，并消耗药品，因而减弱消毒效果。
消毒剂在消毒灭菌过程中的温度、湿度、酸碱度、穿透力、表面张力等因素，都对消毒灭菌的效果有一定影响。
三、生物因素对细菌的影响
在自然界中，细菌与细菌之间，细菌与动植物之间存在着共生和拮抗的关系。我们可以利用生物之间的拮抗作用，使用某些细菌的代谢产物、植物成分等抑制或杀灭病原性细菌，以防治传染病。
(一)抗生素(antibiotie)
抗生素是由放线菌、真菌或细菌等微生物在代谢过程中产生，并能抑制或杀灭其他微生物的有机化合物。
抗生素的种类很多，有些已能人工合成，其抗菌机制主要有以下几种：
1.抑制细胞壁的合成，如青霉素、头孢霉素、杆菌肽等。
2.增加细胞膜的通透性，抑制细胞膜的运输功能，如制霉菌素、多粘菌素等。
3.抑制细菌蛋白质的合成，如氯霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素等。
4.抑制细菌核酸的合成，如新生霉素、争光霉素等。
抗生素在临床上广泛的应用，在治疗传染病上起到了积极作用，但病原菌的耐药菌株日益增多。从患者标本中分离细菌作药物敏感试验，以选用对致病菌敏感的抗生素治疗，是减少耐药菌株和提高抗生素疗效的有效措施之一。
(二)噬菌体(bacteriophage)
噬菌体是寄生于细菌的病毒，具有一定的形态结构和严格的寄生性，需在活的易感细胞内增殖，并常将细菌裂解。
(三)中草药
临床实践和实验研究都证明有很多中草药有抑菌、杀菌作用，如黄连、黄柏、黄芩、连翘、金银花等，其不仅对多种细菌有抗菌作用，而且对某些抗生素耐药菌株也有抗菌效果。

用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。

参考资料：
1. 俞俊棠 生物工艺学--灭菌
2. 邱树毅 生物工艺学