他克莫司对肝移植急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响.pdf

332实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant（ElectronicVersion），July2023，Vol.11，No.4论著 移植免疫他克莫司对肝移植急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响林玲1，袁梦淑1，田小荣1，王玉鑫1，曹欢1，吴龙龙2，田轩2，左怀文1，张新如1，宋红丽3（1.天津医科大学一中心临床学院，天津 300192；2.南开大学医学院，天津 300074；3.天津市第一中心医院器官移植科，天津市器官移植重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 300192）【摘要】目的 探讨他克莫司对心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）供肝移植后急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响。方法 构建稳定运行的常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）系统。夹闭 Lewis 大鼠胸主动脉 30 min 获取 DCD 肝脏，以棕色挪威大鼠（BN）为受体，建立原位肝移植急性排斥反应模型。根据对肝脏的不同处理方法，将 BN 大鼠分为以下 3 组：假手术（Sham）组、单纯NMP（NMP）组及 NMP 联合术后他克莫司（FMP）组，每组 6 只，术后 14 d 收集血液、肝脏和肠道内容物样本。血液标本检测肝功能，HE 染色观察肝脏组织学变化并计算排斥活动指数（rejection activity index，RAI），16 SrDNA 检测肠道内容物，观察各组肠道菌群结构、多样性及功能变化。结果 FMP 组（中位生存期 60 d）大鼠存活时间较 NMP 组（中位生存期为 16.5 d）延长，肝功能和肝组织病理较 NMP 组显著改善（P 0.05）。计算 RAI 结果显示，FMP 组（2.001.23）显著低于 NMP 组（7.601.14）（P 0.05）。与 NMP 组相比，FMP组肠道菌群丰度下降，两组在物种之间有明显差异，FMP 组富含厚壁菌门、阿克曼菌科和毛螺菌科，且富集其他聚糖降解和鞘脂代谢通路。结论 他克莫司能够改善 DCD 供肝移植后急性排斥反应大鼠肝损伤，同时调节肠道菌群结构和代谢途径。【关键词】大鼠；肝移植；他克莫司；常温机械灌注；心脏死亡器官捐献；急性排斥反应；肠道菌群Effect of tacrolimus on intestinal flora in rats with acute rejection after liver transplantationLin Ling1，Yuan Mengshu1，Tian Xiaorong1，Wang Yuxin1，Cao Huan1，Wu Longlong2，Tian Xuan2，Zuo Huaiwen1，Zhang Xinru1，Song Hongli3.1.Tianjin Medical University，First Central Clinical College，Tianjin 300192，China；2.Nankai University，School of Medicine，Tianjin 300074，China；3.Tianjin First Central Hospital，Department of Organ Transplantation，Tianjin Key Laboratory of Organ Transplantation，Tianjin Organ Transplantation Clinical Medical Research Center，Tianjin 300192，China.Corresponding author：Song Hongli，Email： 【Abstract】Objective To investigate the effect of tacrolimus on intestinal flora in donation after circulatory death（DCD）rats with acute rejection after liver transplantation.Methods To establish a stable normothermic machine perfusion（NMP）system.The thoracic aorta of Lewis rats was clamped for 30 minutes to obtain the DCD livers.The acute rejection model of orthotopic liver transplantation was established with brown norway（BN）rats as recipients.According to different treatment methods of liver，BN rats were divided into the following three groups：sham operation DOI：10.3969/j.issn.2095-5332.2023.04.009 基金项目：国家自然科学基金（82070639，81670574）通讯作者：宋红丽，Email：333实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant（ElectronicVersion），July2023，Vol.11，No.4提供，实验流程遵循实验动物伦理规定，并经天津市第一中心医院伦理委员会许可，批号为2016-03-A1。1.2 建立 NMP 系统：根据前期研究7，NMP 系统由器官腔、膜式氧合器、蠕动泵、温度和压力传感器、过滤器和热交换器组成。灌流液总体积为 80 ml，主要成分为 60 ml 含 20%胎牛血清和 1%青链霉素混合液的 DMEM/F12 培养液、20 ml 大鼠自体全 血、肝素（5 U/ml）、地塞米松（2.5 g/ml）和胰岛素（1 U/ml）。1.3 大鼠原位肝移植急性排斥模型建立及分组：Lewis 大鼠为供体，BN 大鼠为受体，利用“二袖套”法建立大鼠肝移植手术模型8，具体参考文献9。实验动物被随机分为 3 组：假手术（Sham）组、单纯机械灌注（NMP）组及他克莫司（FMP）组。Sham 组大鼠仅开腹游离肝脏韧带，不阻断肝脏供血，30 min 后关腹。NMP 组供肝仅进行 NMP。FMP 组供肝单纯进行 NMP，并在移植术后每天以 0.1 mg/kg的剂量灌胃。每组 6 只，术后 14 d 收集血液、肝脏和肠道内容物样本进行检测。1.4 肝脏病理学：肝脏样本固定 24 48 h 后进行脱水、石蜡包埋及切片等步骤处理后进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，显微镜下观察，按 Banff 标准统计排斥活动指数（rejection activity index，RAI），评估组织病理学变化。1.5 肝功能测定：血液样本在室温下进行离心机离心，3000g，10 min 后获得血清样本，使用全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶（alanine 目前肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效治疗手段，由于供肝的持续短缺，心脏死亡器官捐献（donation after circulatory death，DCD）肝脏被广泛应用于移植手术中1。现有的静态冷藏技术作为保存 DCD 供肝的方式常导致术后并发症的高风险和高病死率2。我们前期研究发现，相较于静态冷保存，常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）可有效缓解 DCD 供肝移植过程中的缺血/再灌注损伤3。急性排斥反应是影响移植预后的严重并发症，免疫抑制剂的广泛应用能够有效预防排斥反应的发生，然而与免疫抑制相关的短期和长期风险，如感染、恶性肿瘤、心血管疾病、代谢紊乱及其他并发症也不容忽视4-5。肝脏与肠道之间通过胆道、门静脉和体循环紧密连接6，因此本研究在使用 NMP 系统保存肝脏的基础上，欲探究常用免疫抑制剂他克莫司对于肝移植急性排斥大鼠发挥保护肝脏作用时对肠道菌群的影响，为他克莫司在器官移植领域的安全合理用药提供更充分的指导资料。1 对象与方法1.1 实验材料：他克莫司（安斯泰来制药有限公司，沈阳，中国）。雄性 Lewis 大鼠 12 只，7 8 周龄，200 220 g 为供体；雄性棕色挪威大鼠（brown norway，BN）大鼠 18 只，8 9 周龄，220 240 g为受体，用于制备大鼠原位肝移植急性排斥反应模型。以上实验动物由军事医学科学院实验动物中心（Sham）group，simple NMP（NMP）group and NMP combined with postoperative tacrolimus（FMP）group，with 6 rats in each group.Blood，liver and intestinal content samples were collected 14 days after operation.The liver function of blood samples was detected，the histological changes of liver were observed by HE staining，and the rejection activity index（RAI）was calculated.The intestinal contents were detected by 16SrDNA，and the changes of intestinal flora structure，diversity and function in each group were observed.Results The survival time of rats in FMP group（median survival time 60 d）was longer than that in NMP group（median survival time 16.5 d），and the liver function and liver histopathology were significantly improved than those in NMP group（P 0.05）.The results of RAI showed that FMP group（2.001.23）was significantly lower than NMP group（7.60 1.14）（P 0.05）.Compared with the NMP group，the abundance of intestinal flora in the FMP group was significantly decreased（P 0.05），and there were significant differences between the two groups.FMP group was rich in Firmicutes，Akkermansiaceae and Lachnospiraceae，as well as the other glycan degradation and sphingolipid metabolism pathways.Conclusion Tacrolimus can improve liver injury in rats with acute rejection after transplantation，and regulate the structure of intestinal flora and metabolic pathway.【Key words】Rat；Liver transplantation；Tacrolimus；Normothermic machine perfusion；Donation after circulatory death；Acute rejection；Intestinal flora334实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant（ElectronicVersion），July2023，Vol.11，No.4aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和总胆红素（total bilirubin，TBil）的水平。1.6 粪便 16 SrDNA 分析：收集大鼠回盲部肠道 内容物，立即浸入液氮冻存，随后存放于-80 低温冰箱进行保存，密闭无菌便盒收集的盲肠内容物送至北京博奥晶典生物技术有限公司行高通量 测序。1.7 统计学分析：采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以均数 标准差（xs）表示，采用成组 t 检验或单因素方差分析，P 0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 NMP 系统和大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立：建立了稳定运行的 NMP 系统（图 1A）。术后 14 d 肝脏组织 HE 结果显示：正常大鼠肝脏组织结构完整，未见明显异常（图 1B）。而急性排斥反应模型大鼠肝脏汇管区及中央静脉内皮细胞下有炎症细胞浸润（图 1C），证明急性排斥反应模型建立成功。（图 3D）。结果表明，他克莫司治疗能够显著改善大鼠肝移植排斥损伤模型肝脏病理。与 Sham 组相比，NMP 组和 FMP 组血清 AST、ALT 和 TBil 水平均明显上升，但 FMP 组较 NMP 组，上述指标显著降低，差异有统计学意义（P 0.05）（图 3E G）。结果表明，他克莫司可以显著降低肝移植术后肝功能水平，改善移植术后肝脏损伤的血液指标。图 1 NMP 系统和急性排斥反应大鼠肝脏病理注：A 为 NMP 系统模式图；B 为正常大鼠肝脏 HE；C 为急性排斥反应大鼠肝移植术后 14d 肝脏 HE。图 2他克莫司对 DCD 肝移植排斥反应大鼠生存率的影响（每组 n 5）注：肝移植术后各组大鼠生存率变化。Sham 组、NMP 组和 FMP组的中位生存时间分别为 60d、16.5d 和 60d。2.2 他克莫司能够延长 DCD 肝移植大鼠的生存期：NMP 组大鼠存活时间最短，NMP 联合术后他克莫司显著延长了大鼠存活时间（图 2）。2.3 他克莫司能够改善肝移植急性排斥大鼠的肝损伤：在 Sham 组病理切片中，肝脏组织没有 见到淤血、坏死或者炎性表现（图 3A），NMP 组血窦和中央静脉淤血表现明显，炎症细胞明显浸 润（图 3B），FMP 组，肝小叶中没有看到中央静脉淤血或者组织坏死的情况发生（图 3C）。计算RAI 结果显示，FMP 组（2.001.23）RAI 显著低于NMP 组（7.60 1.14），差异有统计学意义（P 0.05）?2.4 他克莫司对肝移植急性排斥大鼠肠道菌群 的影响2.4.1 物种组成分析：门水平物种组成分析显示（图 4A B），FMP 组中厚壁菌门比例显著高于NMP 组，变形菌门比例显著低于 NMP 组，差异具有统计学意义（P 0.05）。科水平物种组成分析显示（图 4C F），FMP 组中阿克曼菌科和毛螺菌科比例显著高于 NMP 组，梭菌科和脱硫弧菌科显著低于 NMP 组，差异具有统计学意义（P 0.05）。2.4.2 多样性分析：多样性分析显示（表 1），NMP 组 ACE 指 数 和 Chao 指 数 均 低 于 Sham 组，差 异 有 统 计 学 意 义（P 0.05）。与 NMP 组 相比，FMP 组 Chao 指数降低，差异有统计学意义（P 0.05），但两组间 ACE 指数、Shannon 指数和Simpson 指数均无显著差异。基于主坐标分析（principal component analysis，PCA）展示的 多样性分析结果显示（图 5），FMP335实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant（ElectronicVersion），July2023，Vol.11，No.4组的群落结构不同于 Sham 组和 NMP 组，并且其中的主成分占总变化的 39.13%和 16.83%。ANOSIM相似分析证明 FMP 组与其他两组间存在显著差异（P 0.05）。图 4他克莫司对 DCD 肝移植排斥反应大鼠肠道菌群物种组成的影响注：A 为各组大鼠厚壁菌门占比情况；B 为各组大鼠变形菌门占比情况；C 为各组大鼠阿克曼菌科占比情况；D 为各组大鼠梭菌科占比情况；E 为各组大鼠脱硫弧菌科占比情况；F 为各组大鼠毛螺菌科占比情况。与 Sham 组比较，aP 0.05；与 NMP 组比较，bP 0.05。图 3他克莫司对 DCD 肝移植排斥反应大鼠肝脏病理和肝功能的影响注：A 为正常大鼠肝脏 HE（100）；B 为 NMP 组大鼠肝脏 HE（100）；C 为 FMP 组大鼠肝脏 HE（100）；D 为各组大鼠 RAI 比较；E-G为各组大鼠肝功能 ALT、AST 和 TBil 水平比较。与 Sham 组比较，aP 0.05；与 NMP 组比较，bP 0.05。?336实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant（ElectronicVersion），July2023，Vol.11，No.42.4.3 功能基因在代谢途径变化：通过重建未观察到的状态对群落进行系统发育研究（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt）分析显示（图 6），与 NMP 组相比，FMP 组富集其他聚糖降解和鞘脂代谢通路，而铁载体类非核糖体肽生物合成通路的富集程度较 NMP 组 降低。表 1 各组间 OTUs 和 多样性分析（xs）分组OTUsChaoACEShannonSimpsonSham1235.00210.101440.00209.201463.00221.004.230.470.100.06NMP985.80135.401119.00161.701143.00160.603.970.860.090.10FMP738.30194.30803.70206.50840.10224.703.960.440.050.02F11.05316.20513.9510.3560.950P0.0010.000.000.7060.409图 5他克莫司对 DCD 肝移植排斥反应大鼠肠道菌群 PCA分析的影响注：肝移植术后各组大鼠 PCA 分析。图 6他克莫司对 DCD 肝移植排斥反应大鼠代谢途径的影响注：NMP 组与 FMP 组 KEGG 通路差异分析比较。3 讨 论3.1 肝移植是终末期肝病的唯一有效的治疗方 法10。静态冷保存作为 DCD 供肝常用的体外保存方式被发现会增加供肝血流恢复后再灌注损伤的风险11。我们的前期研究发现，与静态冷保存相比，NMP 在常温下模拟机体环境，修复大鼠肝脏损伤，且在第 14 天时保肝效果显著12。移植后排斥反应是导致移植肝功能障碍的主要原因，严重影响患者术后的生存质量和生存率，临床上常用免疫抑制剂来预防并治疗排斥反应5。他克莫司是一种抗 T细胞药物，是一种在移植术后广泛使用的钙调神经磷酸酶抑制剂13。研究发现，在心脏移植后他克莫司的剂量与移植后肠道菌群多样性相互影响14，但是目前肝移植后他克莫司的应用与肠道菌群的关系仍无确定证据。我们的研究发现，他克莫司在显著改善肝移植急性排斥反应大鼠肝损伤的同时，明显降低了术后大鼠的肠道菌群丰度，也对术后大鼠的肠道菌群结构造成了一定的影响。毛螺菌科属于厚壁菌门的梭菌簇 Xa，研究发现，它能够水解淀粉和其他糖类以产生丁酸盐和短链脂肪酸，影响健康功能15。阿克曼菌科属于疣微菌门，研究发现，它对葡萄糖代谢和肠道通透性具有有益作用16。脱硫弧菌被认为是一种机会性病原体，它产生内毒素并具有将硫酸盐还原为硫化氢的能力，从而破坏肠道屏障17。而我们的研究发现，他克莫司能够促进排斥反应后毛螺菌科和阿克曼菌科的比例升高，并且逆转排斥反应后脱硫弧菌比例的升高。本研究发现应用他克莫司后大鼠富集鞘脂代谢通路。鞘脂是在神经系统中高度富集的一类脂质，主要的生物活性鞘脂包括神经酰胺、神经酰胺 1-磷酸酯、葡糖基神经酰胺、鞘氨醇和 1-磷酸鞘氨醇，其中神经酰胺通常抑制细胞增殖并促进凋亡，而 1-磷酸鞘氨醇刺激生长并抑制凋亡，具有极大?337实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant（ElectronicVersion），July2023，Vol.11，No.4的复杂性和多样性18-19。目前，鞘脂代谢途径已成为治疗糖尿病、多发性硬化症和白血病等疾病的生物活性药物开发的重要目标20。但是目前还没有针对他克莫司与鞘脂代谢相关性的研究。总之，我们的研究发现他克莫司可以调节肝移植术后大鼠肠道菌群结构和代谢途径，这为我们提供了一种新的思路，如通过检测肠道菌群来监控肝移植术后免疫抑制剂剂量、血药浓度、使用时间及疗效等对患者的影响，为肝移植技术后接受免疫抑制剂治疗的患者病情评估提供了新的检测策略。参考文献 1 SMITH M，DOMINGUEZ-GIL B，GREER D M，et al.Organ donation after circulatory death：current status and future potentialJ.Intensive Care Med，2019，45（3）：310-321.2 GAO J，HE K，XIA Q，et al.Research progress on hepatic machine perfusionJ.Int J Med Sci，2021，18（9）：1953-1959.3 杨柳，曹欢，孙东，等.常温机械灌注对大鼠心脏死亡器官捐献供肝微循环保护作用的研究 J/CD.实用器官移植电子杂志，2021，9（2）：120-125.4 陈辉星，尹路，彭承宏，等.肝移植免疫抑制剂应用及存在问题 J.国际外科学杂志，2006，33（6）：407-410.5 耿海刚，张汤安苏，肖云飞，等.肝移植术后免疫抑制剂的应用进展 J/CD.实用器官移植电子杂志，2020，8（4）：313-317.6 TRIPATHI A，DEBELIUS J，BRENNER D A，et al.The gut-liver axis and the intersection with the microbiomeJ.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2018，15（7）：397-411.7 侯宾，曹欢，杨柳，等.优化的常温机械灌注保存大鼠心脏死亡后捐献供肝对移植肝中胆管上皮细胞的作用 J.中华肝胆外科杂志，2020，26（2）：139-140.8 KAMADA N，CALNE R 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