微核试验讲义.doc

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实验四、小鼠骨髓细胞微核试验
(一) 目的
通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞(PCE)微核测定方法。
（二）原理
微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1／20—1／5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中的微核。
（三）内容 经腹腔注射环磷酰胺后取材、制片、阅片，筛选标准片
（四）器材与试剂
1. 器材
手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。
2. 试剂
甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液(取Giemsa染料1g，甘油66m1，甲醇60m1。先将染料置于研钵内，加入少量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置，60℃水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该储备液存放的时间越长，染色效果越好。临用时用pH6.8的磷酸盐缓冲液配制为10％的应用液)、pH 6.8的磷酸盐缓冲液。
(1)l/15mol/L磷酸二氢钾(KH2PO4)溶液：称取分析纯KH2P04 9.06g，用蒸馏水溶解并定容至1000m1。
(2)1/15mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)溶液：称取分析纯Na2HP049.45g(或
Na2HPO4·2H2O 11.87g；Na2HPO4·7H2O 17.87g;Na2HPO4·12H2O 23.88g)用蒸馏水
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溶解并定容至1000m1。
(3)pH6.8的磷酸盐缓冲液：取l/15mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和l/
15mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60m1，两者混合均匀即成。
3。阳性对照物 环磷酰胺或丝裂霉素C。
(五)操作步骤
1. 试验动物及处理
(1)动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7～12周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。
(2)染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。
(3)染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作用。不同化学毒物诱发微核出现的高蜂时间也不尽相同。波动范围可以达到24～72h。这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续4天，第5天取样。这样，取样一次就能覆盖24～72h高峰，如果高峰延迟到96h也不会漏掉。
(4)剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般情况下，应设3～5个或更多剂量组，剂量覆盖的范围要达到3个数量级以上。同时还应设立阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺(50～100mg/kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射1次或2次。阴性对照组使用等体积的溶剂。
2.骨髓液的制备和涂片 试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺．用小型弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨骺，用带针头的2m1注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以1000 r/min离心10min，弃去多余的上清液，留下约0.5ml与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的载玻片上，推片。
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阳性及阴性对照组按上述方法同时进行处理。
3.固定 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中、用甲醇溶液固定15min取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保存。
4.染色 将固定晾干后的涂片、用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储备液1份加PH6.8的磷酸盐缓冲液9份）染色10～15min，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。
5.观察计数 先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀．染色较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。

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(六)结果分析与评价
本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核PCE的均值。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算；正常的PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.6～1.2)。如比值＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。
微核试验所获数据资料的频数分布尚无定论，多种统计学方法(如泊松分布、二项分布、X2检验等)均有人用于试验结果的统计分析。该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片及优质的染色。

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