1、
基本技能实验三 柱色谱
一、概述
柱色谱和薄层色谱一样，可以选用不同吸附剂或支持剂。吸附剂或支持剂不同，其分离原理也不同。根据分离原理不同柱色谱一般可以分为吸附柱色谱（常用吸附剂为：硅胶，氧化铝，聚酰胺，活性炭等），分配柱色谱（常用支持剂有：硅胶、硅藻土和纤维素粉），常用固定相为水、缓冲液、甲酰胺等，离子交换树脂柱色谱，凝胶过滤柱色谱，大孔吸附树脂柱色谱等。
为提高定性分析的分离度和精密度以及制备性分离的载样量和效率，在上述柱色谱的基础上又出现了许多新的色谱方法如：液滴逆流柱色谱，各种加压柱色谱（包括高压、中压、低压液相柱色谱），减压柱色谱，干柱色谱，短柱色谱等。
2、
柱色谱的应用：
纯化以及分离制备化学成分
液滴逆流柱色谱和高压液相色谱可以用于定性、定量分析
二、实验目的
掌握柱色谱的操作方法。
三、实验原理
用柱色谱分离化学成分时，经常采用干法装柱和湿法装柱两种操作方法，与之相对应的上样方法也有两种，下面是两种方法的具体操作。
（一）干柱
1. 干法装柱：
在柱下端加少许棉花或玻璃棉，滴几滴溶剂（乙醇或水）于棉花上，用玻璃棒触及棉花使棉花完全粘在玻璃柱上，避免下口漏出硅胶，打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致。
图3-1 用干法装好的色谱柱
3、2. 干法上样：
多数情况下，被分离物质难溶于最初使用的洗脱溶剂，这时可选一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽量少的溶剂将其溶解。根据被分离物质的量，称量2-3倍量的吸附剂装在蒸发皿中，用滴管吸入样品溶液，加入吸附剂中搅拌均匀，自然状态下搅拌挥干溶剂，尽量不加热，以免溶剂挥发过快样品不均匀，干后研磨使之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，表明尽量平，样品带上面再撒一层吸附剂或干净的细砂。
图3-2 干法上样
3. 洗脱：
在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度（或固定比例的混合溶剂）洗脱，各组分则先后被洗出。分段定量收集洗脱液（
4、elute），用薄层色谱检查各流份中的化学成分组成，相同成分合并，回收溶剂。含单一色点的部分用合适的溶剂重结晶，收集结晶。仍为混合物的部分进一步寻找分离方法进行分离。
图3-3 洗脱
（二）湿柱
1. 湿法装柱：
将吸附剂加入合适量的色谱最初使用的洗脱剂调成稀糊状，先把下口放好棉花的色谱柱下口打开，用一长玻璃棒顶住棉花，然后徐徐将制好的稀糊浆倒入色谱柱。注意整个操作要慢，不要将气泡压入吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上面有溶剂，切勿流干。最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。
图3-4 用湿法装好的色谱柱
5、
2. 湿法上样：
把被分离的物质溶在少量色谱最初使用的洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为水平面，打开下口，待液面正好流至与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂。关紧柱塞。
图3-5 湿法上样
3. 洗脱：
在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度（或固定比例的混合溶剂）洗脱，各组分则先后被洗出。分段定量收集洗脱液（elute），用薄层色谱检查各流份中的化学成分组成，相同成分合并，回收溶剂。含单一色点的部分用合适的溶剂重结晶，收集结晶。仍为混合物的部分进一步寻找分离方法
6、进行分离。
四、实验操作
1. 干法装柱：取30 × 2.5 cm玻璃柱一根，底端放一片棉花以防硅胶漏出，打开下口，装入30g硅胶，轻敲均匀后，待用。
2. 伴样：取槐米提取物600 mg，用8 ml甲醇溶解后吸附在2g硅胶（100-200目，柱色谱用）上，在60℃水浴上挥去溶剂，研细制成供柱色谱用样品。
3. 干法上样：在准备好的柱色谱上加入样品，轻敲，并盖一层与样品等高的保护硅胶，上部最好放一片棉花，以免加洗脱剂时砸坏硅胶。
4. 洗脱：用选择好的溶剂洗脱系统CHCl3-MeOH-HCOOH（75 : 25 : 0.5）洗脱，用量约80-100 ml。在日光下和紫外灯下观察，用记号笔在玻璃柱上画出芦丁色带，用玻璃棒或钢铲取出色带，在水浴上挥干溶剂，置于装有滤纸的三角漏斗中，用约30 ml 95%乙醇洗脱，回收乙醇至2-5 ml，放置，析晶。用玻璃漏斗抽滤得到结晶，即芦丁纯品。
5. 产品检识：用硅胶或聚酰胺薄层色谱检查柱色谱产品的纯度。
具体操作见薄层色谱项下。
五、习题
1. 柱色谱按原理分为几类？
2. 简述柱色谱的操作程序。
浙ICP备2021020529号-1 | 浙B2-20240490 
