娃娃鱼繁殖与人工养殖核心技术--培养藻类.doc

娃娃鱼繁殖与人工养殖核心技术 -培养硅藻、维护藻相稳定、也是不二法门 金立成 藻是娃娃鱼繁殖与人工养殖的重要因素，娃娃鱼繁殖率与存活率的高低取决于池中硅藻优寡。养鱼就是养水，养水就是养藻。藻一方面吸收池中营养盐供自身生长与繁殖，另一方面净化水质，同时娃娃鱼提供养料。池中氮磷硫既藻类养源，亦是病原菌、病毒的养源，当池中氮磷硫转化为藻类养源时，那么病原菌、病毒的养源就减少了，病原菌、病毒没有养源它无法分裂与繁殖，从而对水中生物构成不了威胁，也就是不能给水中生物形成感染，没有感染水中生物，那么水中生物自然就不会得病。活藻实验： 本实验发现，五种微藻 N. oculata、I. galbana、C. muelleri、T. chui、S. costatum 皆能达到降低病原菌生长，其中以 T. chui抑制病原菌生长效果最为明显，即浓度 104 cell/ml 环境中在24 小时已完全抑制 病原菌 生长。但是随着 T. chui 浓度的增加，反而无法达到完全抑制病原菌生长的效果，而在浓度105 cell/ml环境中发现，24小时后的菌量有上升之趋势，因此推断三种浓度在相同体积下，由于低浓度104 cell/ml培养出来年轻的藻体细胞较105cell/ml、106 cell/ml 为多，以致于其活性最佳，进而与病原菌 在 同 一 水 体 中 相 互 竞 争 下 短 时 间 内可达到抑制V.alginolyticus 的生长；添加 I. galbana 的抑菌实验中，可发现在三种浓度下皆可达到完全抑制病原菌生长之效果，其中以浓度104 cell/ml 培养环境中较佳，72小时可达到完全抑制病原菌生长；添加 C. muelleri 的抑菌实验中，可发现在三种浓度下皆可降低 病原菌 生长之效果，并且三种浓度皆在 72 小时可达到完全抑制 病原菌 生长之效果；添加 S. costatum 抑菌实验中，可发现在三种浓度下皆可降低 病原菌 生长之效果，且浓度106cell/ml 环境下在 72 小时即可达到完全抑制 病原菌 生长之效果；添加 N. oculata 抑菌实验中，可发现三种浓度皆可降低 V.alginolyticus 生长，其中以浓度 106 cell/ml N. oculata 环境下的效果最佳，在 72 小时达到完全抑制 病原菌 生长。Nieman (1954)和 Galbraith and Miller (1973a,b,c)指出，微藻的抑菌活性取决于脂肪酸碳链的长短，当脂肪酸连接10个以上的碳原子，会使细菌的活性降低，而在后期的研究报告亦证实了微藻的抗菌活性取决于脂肪酸链的长短 (Duff et al., 1966 ； Aubert et al.,1968a,b；Aubert and Gambarotta, 1972；Berland et al., 1972；Aubert etal., 1979；Gauthier, 1980；Cooper et al., 1983；Findlay and Patil, 1984；Pesando, 1985；Visco et al., 1987；Kellam et al., 1988)，另外苏 (1999)指出五种微藻 N. oculata、I. galbana、C. muelleri、T. chui、S.costatum 皆富含高度不饱和脂肪酸(DHA 及 EPA)，故推论本实验结果中的五种微藻皆会抑制 病原菌 生长的原因，可能是其所含有的不饱和脂肪酸皆为碳原子 10 以上，所以有抑制 V.alginolyticus 生长的效果。Kogure et al. (1979)指出，利用不同的光度培养微藻 S.costatum (700、3000、9000 Lux)对于病原菌抑制的效果，其中以3000Lux 抑制效果最佳，另外赵等 (2002)指出此五种微藻的最适培养光照为30004000 Lux，这其中意味着当微藻在最适光照环境下，其生长速率较快，对于病原菌的抑制效果也最好。另外，研究报告也指出微藻在指数生长期间可有效的抑制病原性弧菌的生长(Waksman et al., 1938；Droop and Elson, 1966；Sieburth., 1968；Bell and Mitchell, 1972；Simidu et al., 1977)。而本实验所设置 5 种微藻的培养光照范围为25003500 Lux，并且实验初期所接种的微藻皆为指数期的藻种，而在此条件下所培养的微藻对于病原性弧菌病原菌的抑制皆有良好的效果，推测可能是因为此光照适合五种微藻在指数期的生长，而其生长速率上升会与病原性弧菌病原菌竞争营养盐及生长空间，进而达到抑制弧菌的效果。另外在本实验当中亦发现，将五种微藻震碎后，其细胞内产物亦有抑制病原性弧菌病原菌的效果，而本实验在活体抑制试验当中，所使用的微藻为指数期的活藻，但其中还是会有些许的的藻类会提早老化死亡，这些藻类死亡后所释放出来的胞内产物，可能对于病原性弧菌病原菌有抑制的效果，但有待进一步的实验来探讨其抑制的机制。比较五种微藻 S. costatum、C. muelleri、I. galbana、T. chui、N. oculata 对于病原性弧菌 病原菌 的抑制效果中发现，S.costatum 及 N. oculata 对 病原菌 生长抑制效果不如 T. chui、I. galbana、C. muelleri (Table. 15)。虽然 S. costatum 及 N. oculata 皆有抑制病原菌生长之效果，但是却要在最高的浓度 106cell/ml 才有最佳的抑制效果，而 T. chui、I. galbana 及 C. muelleri 只要在低浓度的情况下就有抑制病原菌的生长，而在现场养殖环境中，若藻色过浓，常会有倒藻、清晨溶氧不足及底部缺氧的情况发生，故在抑制病原性弧菌 病原菌 生长的前提之下，建议以较低浓度的 T. chui、I. galbana 及 C. muelleri 三种微藻来做水，对于养殖池的管理较为容易。 2.2 细胞内产物实验： 微藻之细胞内产物抑制病原性弧菌的实验中显示出五种微藻皆能达到降低病原菌生长的效果。针对五种微藻在不同浓度下之抑菌实验中发现，C. muelleri 在浓度105 cell/ml 环境中抑制效果最佳，24小时后即有降低菌量趋势，而在浓度106 cell/ml环境下，48小时后菌量有明显下降趋势，但是在浓度104 cell/ml环境下，菌量呈现上升现象，因此推断在细胞内产物实验中，低浓度的 C. muelleri 不但无法抑制病原菌生长，反而成为 V.alginolyticus 之营养物质，进而促进菌量滋生。添加 I. galbana 的抑菌实验中，可发现 I. galbana 在浓度 105 cell/ml 环境中抑制效果最佳，24 小时后即有下降菌量趋势，而在浓度106 cell/ml环境下，原先菌量呈现上升趋势，而48小时后菌量即便明显下降，但是在浓度104cell/ml环境下，菌量呈现上升现象，其菌数甚至超越对照组，因此推测在细胞内产物实验中，低浓度的I. galbana 不 但 无 法 抑 制 病原菌 生 长 ， 反 而 成 为 V.alginolyticus 之营养物质，进而促进菌量滋生。添加 S. costatum 的抑菌实验中，可发现 S. costatum 在不同浓度环境下皆可降低 病原菌 生长，以添加不同浓度的骨藻之细胞内产物对生长之影响(Fig. 17)结果显示，发现各个处理组其菌量呈现一个平稳状态，且与对照组比较之下，菌量明显较低，因此推测S. costatum 之细胞内产物中，可能含有某些酵素或其他成分可以抑制 病原菌 生长，添加 N. oculata 的抑菌实验中，发现 N. oculata 随着浓度的提高其菌量明显的降低，在浓度 105 cell/ml 环境中 72 小时菌量有下降的趋势，而 106 cell/ml 环境中在 96 小时也有菌量降低之现象，因此推测在细胞内产物实验中 N. oculata 在低浓度环境下无法抑制 V.alginolyticus 生长，反而成为 病原菌 之营养物质，进而促进菌量滋生。添加 T. chui 的抑菌实验中，可发现 T. chui 在初期时三种浓度皆无法降低 病原菌 生长，且菌量明显比对照组高，而后在 48小 时 浓 度 106 cell/ml 环 境 下 其 菌 量 急 速 下 降 ， 转 为 抑 制 V.alginolyticus 生长，因此推测在细胞内产物实验中，低浓度的 T. chui不但无法抑制 病原菌 生长，反而成为 病原菌 之营养物质，进而促进菌量滋生。微藻之细胞内产物抑制 病原菌 生长之实验中，经由实验结果推测出五种微藻在浓度 104 cell/ml 环境下除了 S.costatum 以外，其余四种微藻皆无法降低 病原菌 生长；105cell/ml 环境下 I. galbana、C. muelleri、S. costatum 可降低 V.alginolyticus 生长，而在 72 小时以后，N. oculata 也有菌量降低之现象；在106 cell/ml 环境下，五种微藻皆可降低病原菌生长 综合细胞内产物实验结果，故推测以添加 S. costatum 有最佳之抑制效果，主要为此微藻不管是低浓度或高浓度皆可降低 V.alginolyticus 的生长。早期的研究报告证实了Chaetoceros spp.、T. suecica、S. costatum确实能够降低弧菌属的滋生(Table. 20)，而综合本实验结果证实了微藻确实能够有效抑制 病原菌，活藻的抑制实验发现，其可与病原菌之间达到竞争营养盐、空间或者以脂肪酸类的物质抑制弧菌的生长；在经震碎后的细胞内产物中也发现，微藻细胞内可能含 有 抑 制 病 原 菌 生 长 的 物 质 ， 其 中 包 含 了 autoinhibitor(15-hydroxyeicosapentaenoic acid)，究竟抑制细菌的物质为何，有待进一步实验探讨。 这些研究结果证实，池中藻类成为优势时，就抑制了病原菌的生长，池中没有病原菌，娃娃鱼自然不会发生疾病。所以、无论是繁育娃娃鱼，还是人工养殖娃娃鱼，着重的是养藻与维护藻相的稳定。8