大肠杆菌感受态制备.doc

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
概 述
　　在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
　　转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
　　转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。本实验室一般用TSS法制备感受态。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：
　　1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

　　2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
　　3. 试剂的质量: 所用的试剂均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
　　4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用TSS缓冲液处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
一. 材料
　　E. coli DH5α菌株
二. 设备
　　恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
三.准备工作
LB固体培养基、LB液体培养基、1.5ml离心管、牙签、1ml枪头、200ultip
50ml离心管、空三角瓶、一包平皿等；
注：以上物品试剂高压灭菌备用，最好现用现备比较好，避免感受态被污染。
四. 试剂

1.LB固体和液体培养基
100ml
1% Tryptone（胰化蛋白胨） 1g
0.5% yeast EXtrat （酵母提取物） 0.5g
1%Nacl 1g
1.5% Agarose(LB固体培养基) 1—1.5g
2.Amp母液：抗生素，一般实验室配制的amp浓度为100ng/ul，按照1000:1的比例加入到LB培养基中（注：100mlLB中加入100 ul的amp抗生素）。
3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.缓冲液1×TSS的配制
TSS 100ml
10%PEG3350 10g
5%DMSO 5g
20mm MgSO4 2ml（1M MgSO4）
液体LB 98ml
注： 事先配制1M的氯化镁――20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取98mlLB，加入至烧杯中，取10 g PEGMW= 3350), 5ml DMSO，2ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22μm 滤器过滤除菌。储存在-20度，保质期约6个月。
TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）
五：制备步骤
1、划线——在感受态制备前一天夜晚划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养菌种――Dh5α；
2、小样摇菌——挑取5-6个单克隆菌斑接种到1ml无抗液体LB中，置于37度恒温振荡培养箱中振荡培养，一般培养6-8h(小样摇菌)。.
3、 大样摇菌——按照1:100的比例将小样培养的菌液（500μl）加入到新的无抗的液体LB培养基中，置于37度恒温振荡培养箱中振荡培养，一般培养3-4h(大样摇菌)振荡培养至OD600为0.4—0.5即可。
4、将准备好的菌液冰浴30min后，分装到50ml离心管中，4℃、4000rmp离心10min，弃上清收集菌体，加入原体积1/10（5ml）的1×TSS缓冲液（缓冲液在冰上预冷30min）悬浮细胞，分装成100μl/1份在1.5ml离心管中，全部过程冰上操作，分装完成的感受态-80℃保存，一旦从超低温冰箱取出的感受态不能重新放回，反复冻融会影响转化效率。（50ml离心管、1.5ml离心管提前放在-20℃冰箱预冷）
六、 转化时取一管（100μl）感受态细菌，（感受态细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入20μl KCM（5M KCM），加入70μl ddH2O，加入3-5μl连接产物 （DNA、0.1～100ng），轻轻混匀后冰浴30min，37℃水浴热激5min，立即置于冰上。加入0.2ml含20mmol/L液体LB培养基，37度150r/min温和振荡培养 60-90min，枪取100μl菌液于AMP抗性的LB平板上，涂布均匀，待平板上菌液吹干后，放于37度恒温培养箱过夜培养
四、 计算转化率
　　统计每个培养皿中的菌落数。
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
　　[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。