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dsRNA和RNA干扰技术
综述 *** 审校 彭**
(中南大学湘雅医学院)
摘要：dsRNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。其机理的日渐阐明使它有可能在基因敲除，基因功能测定等方面成为一项成熟的技术，这将在生命科学领域中引起深刻变化。本文就dsRNA和RNA干扰的关系，RNA干扰的机制和特点, RNA干扰技术的应用前景等作一综述。

关键词：dsRNA; RNA干扰 ; RNA干扰技术; 基因沉寂

外源和内源性双链RNA（double-stranded RNA dsRNA） 在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。早在十年前，科学家们在向牵牛花转导色素合成基因时，观察到“共抑制”（cosupression）,不仅是转入的基因为表达，而且自身的色素合成也减弱了。相似的现象还发生在真菌的研究中，当把合成类胡萝卜素的基因转入到红色面包霉中时，却导致了大约30％转染细胞自身基因的失活，这种现象称为“缓解”（quelling）。但是这种现象一直得不到令人信服的解释。1998年，在研究秀丽隐杆线虫基因沉默机制时发现，将反义RNA、正义RNA和双链RNA分别导入虫体内，作为对照组的正义核酸，虽不能与活性基因或mRNA结合，却同反义核酸有相似的阻断基因表达能力，与反义RNA传统机制相违背、而另人惊奇的是，双链RNA较正义RNA和反义RNA能更高效地阻断相应基因的表达，一直基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级。Fire等称这种现象为RNA干扰现象。RNA干扰现象已证实在一系列的生物中存在，包括植物[1]、真菌[2]、锥虫[3]、囊虫[4]、果蝇[5]和线虫 [6]。新近科学家在哺乳动物细胞中也观察到了这一现象[7]。生物界普遍存在的RNA干扰现象给现代生命科学所带来的冲击将是无法估量的，它将不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。

一、dsRNA的形成
由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，正常机体任何导致dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达显然需要一套严密防止dsRNA形成的机制。这些机制包括：在进化水平上淘汰那些在两条DNA链上相应位置上都有启动子的基因，否则两条DNA链同时转录出两条互补的RNA就可能形成dsRNA；在正常生理条件下dsRNA的形成必须具有一定的条件如两条互补RNA链相遇，互相识别和一定浓度的RNA连接蛋白存在；在偶然情况下形成的dsRNA还必须具有抵御解链，共价修饰和降解双链RNA等酶作用的能力。此外，细胞对于外来的RNA和自身转录过程中生成的变异RNA（aberrant RNA）所产生的dsRNA引发RNA干扰能力大于拥有自身mRNA序列的dsRNA。与这些设想一致的实验在线虫和锥虫中得到证实[8]。
引发RNA干扰的dsRNA产生机制是通过对RNA干扰现象深入研究推断而来的。它包括内源性和外源性两个方面：RNA干扰作为一种防御外来核酸的免疫机制，外来核酸（包括DNA和RNA）的侵入就可能导致dsRNA的产生，如RNA病毒的入侵，DNA病毒在胞内的转录，基因工程中导入转基因，插入逆转的DNA片段等；内源性的dsRNA产生主要是通过RNA依赖的RNA合成酶（RDRP）的作用，它催化合成与机体转录过程中形成的异常RNA互补RNA链而形成dsRNA[9]。

二、dsRNA介导RNA干扰的机制
1998年Andrew Fire将dsRNA导入线虫内观察到RNA干扰现象后[6]，科学家又在一系列的低等生物中观察到同样的现象，然而将dsRNA（长度＞30bp）导入常用哺乳动物细胞培养株时却不能观察到特异的RNA干扰现象，而是出现诱生干扰素，活化核糖核酸酶L，细胞的基因表达全面受抑和细胞凋亡的现象[5，9]。这不禁使人疑问，哺乳动物中能不能被dsRNA诱导出RNA干扰。但是，实验证明，小鼠的卵母细胞和早期的胚胎中却存在这一现象[10]。随后，Zamore的研究小组发现诱发RNA干扰时dsRNA被切成21-25个碱基的RNA片段[11]，同样，这些小片段的RNA也在果绳细胞外RNA干扰模型中出现[12]。科学家把这种小片段的RNA称为小干扰RNA（small interfering RNA siRNA），并且猜测RNA干扰正是由siRNA诱导。Elbashir SM工作组将体外合成的21nt的siRNA导入哺乳动物细胞培养株中也检测到了特异的RNA干扰现象[7]。

如图所示：内源性dsRNA在细胞内ATP和Dicer酶作用下切割为小片段干扰的干扰RNA，siRNA和另外几种蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。RISC结合与siRNA互补的同源基因的mRNA后，mRNA被复合物中具有RNA酶作用蛋白酶降解。从而导致该基因的表达沉默。外源性的siRNA，和细胞内产生的发夹RNA都是在细胞质中形成RNA的沉默复合物发挥作用。

尽管RNA干扰的具体的机制和过程还不十分的清楚，研究资料显示RNA干扰过程可概括如下：第一步是dsRNA的处理；dsRNA经过一种核酸酶Ⅲ类似的RNA内切酶Dicer作用，把dsRNA链酶切成长约21到25nt的dsRNA链，每条链都有2个碱基的突出。对线虫和哺乳动物Dicer分析表明，该酶包含三个区域：螺旋酶区，dsRNA结合区，PAZ区[13]。第二步是siRNA介导的同源mRNA降解：siRNA和另一些尚未完全确认的蛋白结合形成复合物——RNA诱导沉默复合物（RNA-inducing silence complex, RISC）。RISC再识别，结合与siRNA中的反义链互补的mRNA。RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA[14]，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端[11]。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而使该基因的表达受抑，这就是转录后的基因沉默（post-transcription gene silencing PTGS）。RISC的大多数蛋白质成分没有得到确认，推测它们可能包括核酸内切酶，核酸外切酶，螺旋酶和同源搜寻活性结构域[14]。
值得注意的是dsRNA（＞30bp）不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞全面的基因表达受抑和凋亡。研究显示dsRNA（＞30bp）导入哺乳动物细胞可诱导干扰素的合成。在这一过程中，dsRNA结合并激活蛋白激酶K（PKR）[15]和2′5′-寡腺苷酸合成酶（2′5′-AS）[16]。活化的PKR磷酸化翻译启始因子eIF2α使其活性降低从而抑制基因表达；经激活的2′5′-AS合成2′5′-寡腺苷酸则可活化一种核糖核酸酶L降解mRNA。结果是非特异性的和全面的抑制基因表达，最终导致细胞凋亡。

三、RNA干扰的特点
RNA干扰以被美国科学杂志评为2001年十大科技突破之一，有关研究文献相继在权威杂志发表，科学家对RNA干扰现象之所以表现出极大关注和兴趣，就在于RNA干扰在基因功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。
1. 特异性 RNA干扰的最显著特征就是只引起与dsRNA 同源的mRNA降解。实验表明，dsRNA 能在果蝇细胞中特异性的抑制外来的短暂表达，稳定表达的转基因和细胞内自身固有的内源基因表达，而对其它无关基因的表达不受影响。
2. 高效性 无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA （每个细胞几个分子）就能有效的抑制靶基因表达，抑制的效率在低等动物中＞90%。这表明dsRNA 介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的[6]。
3．dsRNA长度限制性 引发有效RNA干扰的dsRNA最短不得短于21碱基，而且长链ds RNA也在细胞内被Dicer酶切割为21nt左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。
4． 可传播性 RNA干扰有一种令人惊奇的跨越细胞界限的能力，在果蝇细胞中可在细胞群落之间传播[5]。在线虫中可在局部注射dsRNA 而传播到整个机体[6]。研究人员给实验鼠尾部的血管注入旨在“沉默”FAs基因的小干扰RNA，发现有90%的肝细胞接收到了这种RNA分子。
5. ATP依赖性 在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程[11]。可能是Dicer和RISC的酶切反应是必须由ATP提供能量。

四、RNA干扰技术的意义
依据RNA干扰现象，科学家建立了RNA干扰技术，即人为设计合成针对某特定基因序列的dsRNA来关闭或抑制该基因的表达。尽管RNA干扰尚存在一些问题，要成为一项成熟的技术还有待时日。但RNA干扰已被多次证实是一种特异、高效、经济的使基因表达受抑的技术手段。它可有效地将靶基因的表达水平降到一个低的水平，甚至于完全的清除。美国麻省理工大学医学中心Phillip Zamore预言“RNA干扰将在哺乳动物细胞遗传学上引起革命性的变化。”人们不再需要花6个月的时间设法去关闭某个基因的表达，利用这项技术，可以在一周之内就可关闭10个基因。
一旦RNA干扰技术得到完善，它给生命科学领域的冲击是无法估量的。它有可能在以下几方面发挥重要的作用。①基因功能的研究：与使用基因敲除技术来检测基因功能相比，RNA技术却能方便，快捷的达到这一目的，即使是在一般条件的实验室也可开展这项工作。科学家已经利用它检测了线虫两个染色体上几乎所有的基因功能[17，18]。RNA干扰技术可在功能基因组的研究中发挥重要作用。②抗病毒作用 我们可将病毒在复制中起关键作用的基因作为目标设计dsRNA来抑制病毒的复制。自1986年植物学家首次利用转入烟草花叶病毒（TMV）的核衣壳（CP）基因导入植株培育出抗病毒植株后，已培育了一大批抗病毒植株[19]。最近，斯坦福大学在小鼠内进行RNA干扰实验成功的防止细胞受丙型肝炎病毒感染 [20] 。麻省理工学院用RNA干扰技术封锁了艾滋病病毒的基因[21]。③基因治疗 RNA干扰技术开辟了基因治疗的新思路。我们可以用抑制疾病基因表达的办法来达到治疗目的，臂如导入针对致癌基因的dsRNA来防治癌症。哈佛医学院在实验小鼠中设计针对凋亡相关蛋白质（Fas）基因的干扰RNA成功的治疗了小鼠的肝炎[22]。
五、RNA干扰中存在的问题
如前所述RNA干扰现象的发现和RNA干扰技术的建立给生命科学领域带来巨大的冲击和光明的前景。但已有的实验也表明，RNA干扰尚存在一些问题待解决如：可能存在一些基因或组织具有抵抗RNA干扰的能力，线虫的神经系统即具有这种能力[8]；dsRNA序列选择不同可能导致不同的抑制效果，并且只能在外显子序列中选择[7]；在哺乳动物中诱导RNA干扰必须是21nt左右的siRNA ，而且其抑制效果不如在低等生物中。RNA干扰对稳定，丰富表达的靶基因抑制效率不高[23]；此外，RNA干扰和反义RNA技术一些相似的缺点，如寡聚核酸合成困难，易被降解，细胞摄取效率低等。
这些问题的最终解决尚有待于RNA干扰机制的彻底阐明。目前科学家采取的策略是针对靶基因外显子不同序列体外合成多对21nt的siRNA，并在其3'端设计两个胸腺嘧啶T突出以防止RNA酶的降解，观察并确认抑制效果最大的序列。

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