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人牙周膜细胞在双氧水处理后纯钛表面的活性
【关键词】  牙周膜； 细胞培养； 钛； 碱性磷酸酶； 人牙周膜细胞； 双氧水
　　［Abstract］ Objective: To investigate the application possibility of hydrogen peroxide pre-treated titanium in oral clinic. Methods: The proliferation and alkaline phosphatase （ALP） activity of human periodontal ligament （hPDL） cells attached on titanium with four kinds of surface （smooth, rough, etched, hydrogen peroxide treated）were detected. The growth of primary and passaging cells was observed with invert microscope, and the morphology of cells was observed with scanning electronic microscope （SEM）; ALP activity was tested with enzyme-linked immunosorbant assay. The morphology, immunohistochemistry features, proliferation and ALP acyivity of cells on the four kinds of titanium were compared. Results: The hPDL cells could grow and proliferate on four kinds of titanium. The cell proliferation on titanium treated by hydrogen peroxide was better than those in the other three groups（P＜0.05）. Conclusion: Titanium treated by hydrogen peroxide is more beneficial to attachment and proliferation of the cells than titanium processed by the other three ways. Cells in the four groups all showed ALP activity, and among them, the activity in cells of hydrogen peroxide treated group is the highest（P＜0.05）.
　　［Key words］ periodontal ligament; cells culture; titantium; alkaline phosphatase; human periodontal ligament cells; hydrogen peroxide
　　种植体以其有效的支持、良好的咀嚼功能、方便的清洁和护理被广泛应用于口腔临床治疗中。理想的种植体要求种植体-软组织界面有类似天然牙上皮附着的结构，形成紧密的上皮“袖口”，成为一种功能性生物屏障。它有保护种植体在复杂的口腔环境中免受细菌及其他致炎因子侵入而保持长期稳定的作用。近代牙周病学已证明：牙周组织再生的细胞学基础是牙周膜细胞，而牙周膜细胞是牙周膜中最多、功能上也是最重要的细胞［1］。它是种植体-软组织界面中的重要组成部分，研究发现其具有一定的异质性既有成纤维细胞的特性，又有成骨细胞的特性，如：具有较高的碱性磷酸酶（ALP）活性、能合成和分泌大量的胶原和非胶原蛋白等［2］。钛金属以其良好的生物活性被作为首选的种植体材料并广泛应用于临床，但其初期的稳定性及长期的成功率仍不能让人满意［3］。为此，采用体外培养人牙周膜细胞（hPDL）的方法对其在经过4种不同处理的钛片上的生长、增殖及活性进行检测。
　　1  材料与方法
　　1.1 实验器械
　　钛片（宝鸡科迪普有色金属加工有限公司），扫描电镜（S-3400N,日本日立公司），倒置显微镜（XD-101型，南京江南电股份有限公司；超净工作台（苏州净化设备公司），离心机（TDL-40型，上海安亭科学仪器厂）；酶标光度仪（Bio-Tek E1312E,USA），细胞计数板（浙江省玉环县求精医用仪器厂）。
　　1.2 实验材料
　　α-MEM培养基（海克隆生物化学制品有限公司），胎牛血请（杭州四季青公司），胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶（美国Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO，捷瑞生物工程有限公司），MTT试剂盒（凯基生物科技发展有限公司，KeyGen），ALP检测试剂盒（南京建成公司），波形丝蛋白抗体、角蛋白抗体、免疫组织化学试剂盒（武汉博士得公司）。
　　1.3  实验步骤
　　1.3.1  钛片的处理
　　光滑组与粗化组钛片由西安宝鸡科迪普有色金属加工有限公司制备提供。具体方法如下：用直径10 mm纯钛棒线切割加工成厚1 mm的圆钛片，以金相砂逐级打磨至1 200目，直至表面平滑、呈现灰白的金属色为止，然后用丙酮、75％乙醇和去离子水在超声清洗器（KQ250）轮流清洗15 min,以除去材料表面机械加工而残留的油污，40 ℃烤箱烘干，即得到光滑组钛片。再以40目金刚砂喷光滑钛片的表面，每试样30片﹙样本表面呈均一灰色﹚，进行上述同样的超声清洗后，40 ℃烤箱烘干，得到粗化组钛片。钛片的分组：钛片经以上处理后分为4组：光滑组、粗化组、酸蚀组（同粗化组处理后用5.8 mol/L HCl和8.96 mol/L H2SO4混合液处理10 min，双蒸水冲洗，50％干燥）及双氧水组（同酸蚀组处理后，8.8 mol/LH2O280 ℃处理30 min,400 ℃热处理1 h）。
　　1.3.2 人牙周膜细胞﹙Human Periodontal Cells hPDL﹚的原代培养及传代
　　（1）组织来源：正畸需拔除的11～17岁青少年的双尖牙（A、B、C、D四区均可），无炎症、无龋坏的正常牙齿（贵阳医学院附院颌面外科提供）；（2）细胞培养：取11～17岁青少年正畸需拔除的双尖牙用生理盐水冲洗3遍，放入加有10 ％双抗的DMEM培养基中立即带回实验室，在超净工作台上用加入10％双抗和10％甲硝唑的D-Hanks液冲洗3遍。然后将牙齿放入含0.1％Ⅰ型胶原酶（2 ml）的青霉素小瓶中，在37 ℃孵育箱中消化1 h并且每10 min震荡1次。终止消化后用吸管吹打牙齿根面，离心8 min（1 000 r/min），加入含10％血清和1％双抗的高糖的a-MEM培养基，移入培养瓶中并将培养瓶放入37 ℃CO2孵育箱中培养，镜下见细胞贴壁后隔日换液；（3）hPDL的传代：待细胞长至瓶底80％后，用25%的胰蛋白酶以1∶2消化传代。
　　1.3.3  hPDL的鉴定
　　取生长良好的第4代细胞做细胞爬片，1周后采用ABC法进行波形丝蛋白和角蛋白染色鉴定人牙周膜细胞。正常的hPDL来源于中胚层，抗波形丝蛋白阳性，而抗角蛋白染色阴性。
　　1.3.4  hPDL的HE染色
　　取生长良好的第4代细胞做细胞爬片，1周后将爬片取出，丙酮固定后常规HE染色，光镜下观察并拍照。
　　1.3.5  hPDL的接种
　　将处理好的钛片置于12孔培养板内，取生长良好的第4代牙周膜细胞，0.25％的胰蛋白酶消化后调整细胞浓度至10×104/ml,取0.1 ml该细胞悬液涂布于钛片表面，6 h后每孔加入1 ml H-DMEM培养基，放入37 ℃CO2孵育箱中继续培养。
　　1.3.6  MTT法检测材料的细胞毒性
　　取生长良好的第4代细胞，将其按1×104个接种到24孔板中，每孔培养液0.2 ml，分为4组，每组20个复孔，细胞贴壁后第2天每孔加入MTT溶液0.5 ml，离心后在37 ℃CO2孵育箱中继续培养4 h后弃去上清培养液，每孔加入1 ml二甲基亚砜（DMSO），在摇床上震荡15 min，使结晶物充分溶解。选择波长550 nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，每组20个样本求均值。
　　1.3.7  钛片表面hPDL数的测定
　　分别于接种后每天取出钛片各20块D-Hanks冲洗3遍，置入另一块洁净的24孔培养板内，胰蛋白酶消化2 min，吸出胰蛋白酶，加入含血清的DMEM，每孔0.5 ml。用吸管吹打钛片表面，用血球记数板计数，将计算结果换算为每毫升悬液所含细胞数，每组重复计数4次。每天计数1次，共计数8 d。
　　1.3.8  hPDL的ALP活性检测
　　取生长良好的第4代细胞接种（分为4组，每组20块钛片），每孔加入矿化液（1×10-2mol/L B甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C、1×10-7mol/L地塞米松）培养2 d，每孔加入0.1 ml 0.1％tritonX-100,4 ℃过夜。加入底物37 ℃培养30 min，用0.1 ％NaOH终止反应。酶标仪测OD值，波长520 nm。每组20个样本求均值。测6 d，以矿化时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制人牙周膜成纤维细胞的ALP活性图。
　　1.3.9  扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）观察4种钛片表面形态
　　取已经处理完毕的钛片各1片（共4片）置于扫描电子显微镜下观察其表面形态。实验条件：加速电压30 kV，电流5×10-10，工作距离15mm。
　　1.3.10  扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）观察人牙周膜细胞在4种钛片上的生长形态
　　将生长良好的第4代细胞接种在钛片上培养3 d，PBS冲洗3遍，戊二醛固定30 min，自然干燥后喷金，扫描电镜下观察细胞形态并拍照。实验条件：加速电压30 kV，电流5×10-10，工作距离15 mm。
　　1.4 统计分析
　　实验结果选用SPSS11.0统计软件包，数据用均值±标准差（x±s）表示，采用方差分析，P<0.05时差别有统计学意义。
2 结果
　　2.1 人牙周膜细胞的形态细胞呈梭形、多角形或星形，胞突细长，胞浆丰满，细胞核1～2个，呈圆形或椭圆形。细胞密度较低时交织成网状，细胞密度较高时排列成束状或旋涡状。见图1和图2。
　　2.2  人牙周膜细胞的鉴定免疫组织化学实验显示细胞波形丝蛋白染色阳性，胞浆为棕黄色；角蛋白染色阴性，苏木精复染后胞核呈紫色证明为中胚层组织来源。
　　2.3  扫描电镜下钛片的表面形态   
　　扫描电镜照片清楚的显示了四组钛片样本的表面形态差异（见图5～8）。光滑组钛片表面在电镜下显示出由于砂纸打磨造成的规则的环状打磨线条，但是表面基本光滑，无明显的凸起和凹陷；粗化钛片表面非常粗糙，有非常不规则的不同形态的凹陷和尖锐的凸起；酸处理钛片表面微孔较粗化组小且均匀；双氧水处理钛片表面出现多级孔洞的结构，并且表面的凸起和凹陷也较粗化钛片及酸处理钛片更为柔和，还可以看到表面有一些比较均匀的结节状沉积层，钛表面被完全覆盖。
　　2.4  细胞接种在4组钛片上的扫描电镜观察细胞在4组钛片上都能生长而且形态相似，都呈不规则的梭形。见图9～12。
　　2.5  MTT法检测材料的细胞毒性取3份样本读取的平均值作为最后的实验结果。计算细胞相对增殖率RCR％=实验组OD值/空白对照组OD值。用5级毒性分级法评定材料的细胞毒性［4］。见表1。表1  人牙周膜细胞的相对增殖率及材料毒性评级（略）
　　2.6  细胞计数结果以培养天数为横坐标，细胞计数为纵坐标绘制的细胞计数图。见图13。经统计学分析：第1天4组细胞的计数差异无统计学意义﹙P＞0.05﹚，从第2天到第8天差异有统计学意义﹙P＜0.05﹚。
　　2.7  hPDL的ALP活性检测以矿化时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制hPDL的ALP图。从图14可以看出，加入矿化液后第1天4组钛片上hPDL都表现出了ALP活性，但是差别无统计学意义（P＞0.05）。在第2、3、4天4组的ALP活性处于波动期。到第5、6天ALP活性趋于稳定而且4组细胞的ALP活性差别有统计学意义（P＜0.05）。其中双氧水组细胞的ALP活性最高（P＜0.05）。
　　3  讨论
　　3.1  hPDL相对增殖率及材料毒性评级实验结果显示，光滑组细胞增殖率为80.94％，材料毒性评级1级，粗糙组细胞增殖率为114％，材料毒性评级0级；酸蚀组的细胞增殖率为123％，材料毒性评级为0级；双氧水组细胞增殖率为140％，材料毒性评级0级。说明这4组钛片表面毒性评级为无毒、低毒，都可以作为人体口腔种植材料。　　
　　细胞在4组钛片上的增殖曲线显示，细胞从第2天开始分裂增殖活跃，呈对数生长，到第7天细胞达到饱和密度时，细胞生长处于停滞状态。细胞生长曲线呈滞缓-对数生长-平台模式。统计结果显示，4组细胞的生长及增殖有差异，而且双氧水组细胞的生长及增殖最快（P＜0.01）。
　　3.2  钛片的表面形态对hPDL的影响　　
　　国外有学者通过研究光滑表面与粗糙表面人牙周膜细胞移行、黏附及排列的影响，得出粗糙表面有利于细胞的移行、黏附及排列［5］。在本实验中，光滑组钛片表面hPDL的相对增殖率为80.83％～81.06％，粗化组钛片表面hPDL的相对增殖率为114％～115％，酸蚀组钛片表面hPDL的相对增殖率为123％～124％，双氧水钛片表面hPDL的相对增殖率为140％～141％。粗化组、酸蚀组、双氧水组都形成了不同程度的粗糙面，因此，这3组钛片表面细胞的生长与增殖都明显高于光滑组。而在这3组中，双氧水组细胞的生长及增殖最快（P＜0.05），这个结果可能与双氧水处理后钛片表面能形成多级孔洞的结构有关。双氧水处理钛片表面是一种新的化学蚀刻方法，2005年何福明［6］等研究发现。双氧水法处理钛片后扫描电镜观察可以得到粗糙的表面，并形成明显的多级孔洞结构。
　　3.3  细胞在4种钛片表面的ALP活性ALP活性是牙齿和骨等硬组织形成、代谢、再生过程中的重要矿化酶，同时ALP又是细胞分化成熟和成骨能力的重要标志酶，是前体细胞向骨化亚群细胞分化和向骨组织转化的前提［7］。hPDL有向成骨细胞和成牙骨质细胞转化的趋势，ALP活性的变化可以显示其向成骨细胞转化的能力［8］。从人牙周膜细胞ALP活性图可以看到，在加入矿化液以后，人牙周膜细胞在4种经不同方法处理的钛片表面都表现出了ALP活性，并且都是达到峰值后下降并保持在一个相对稳定的水平，该结果可以说明矿化液对牙周膜细胞有成骨诱导作用。牙周膜细胞在适当的条件下可以参与矿化。其他学者的研究也证明，hPDL有向成骨细胞和成牙骨质细胞转化的趋势，ALP活性的变化可以给予hPDL一定的诱导条件后，细胞表现出成骨倾向，即约在20 d左右可以观察到矿化结节的出现，同时可以检测到骨延蛋白和骨桥素在细胞矿化过程中的表达，而且hPDL的ALP活性是牙龈成纤维细胞的1.6～13.3倍［9～12］。本实验的结果是在达到峰值后双氧水组细胞的ALP活性保持在最高水平（P＜0.05），这可能与双氧水处理后钛片表面能诱导形成羟基磷灰石有关。因为传统的粗化法和酸蚀法所形成的钛片表面为无定形的TiO2层，无体外诱导磷灰石形成的能力。研究发现，双氧水处理可以在钛金属表面获得一层富含Ti-OH基团的非晶态TiO2层［13］。经过400 ℃热处理后非晶态的TiO2结晶转变为锐钛矿晶相结构。2004年，Rohanizadeh等［14］的研究证实了锐钛矿晶相结构表面更易诱导羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）结晶。经H2O2预处理组表面ＨA与钛基体结合强度更高。
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