木栓酮合酶TwOSC1的产物异构化研究.pdf

第4 5卷 第3期华北理工大学学报(自然科学版)V o l.4 5 N o.32 0 2 3年0 7月J o u r n a l o fN o r t hC h i n aU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y(N a t u r a lS c i e n c eE d i t i o n)J u l.2 0 2 3 收稿日期:2 0 2 2-0 2-2 6 修回日期:2 0 2 3-0 6-1 0基金项目:国家自然科学基金(3 2 1 7 1 4 3 0);河北省自然科学基金(B 2 0 2 1 2 0 9 0 0 8);华北理工大学省属高校基本科研业务费项目(J QN 2 0 2 0 0 0 3)。第一作者:张凯月,女,硕士研究生。通讯作者:王洋,男,博士,副教授。研究方向:生物化学与分子生物学。E-m a i l:k o n i g 7 1 81 6 3.c o m。D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.2 0 9 5-2 7 1 6.2 0 2 3.0 3.0 1 4文章编号:2 0 9 5-2 7 1 6(2 0 2 3)0 3-0 1 1 0-0 8木栓酮合酶T wO S C 1的产物异构化研究张凯月,邹旭,张晨烁,余源,王洋(华北理工大学 生命科学学院,河北 唐山0 6 3 2 1 0)关键词:蛋白质工程;木栓酮合酶;木栓酮;-香树脂醇;-香树脂醇摘 要:来源于雷公藤的木栓酮合酶T wO S C 1能够催化(3 S)-2,3-氧化鲨烯生成木栓酮、-香树脂醇和-香树脂醇,三者比例为3:1:1。将T wO S C 1引入酿酒酵母能够合成木栓酮,但产量较低,无法达到工业化生产的需求,T wO S C 1催化活性低,产物专一性差是影响其产量的主要瓶颈。通过理性和半理性设计分析T wO S C 1的关键氨基酸残基位点,利用蛋白质工程对关键氨基酸残基(N 1 1、G 2 8 0、I 2 5 9、I 5 4 8、M 5 5 2)进行改造。研究结果表明,突变体N 1 1 I、N 1 1 A、N 1 1W、N 1 1 R、N 1 1 F、I 5 4 8W、I 5 4 8 L的 木 栓 酮 产 量 降 低;突 变 体G 2 8 0 H、G 2 8 0 P、G 2 8 0 S、M 5 5 2 S的木栓酮产量提高,且T wO S C 1 G 2 8 0 H催化活性最好,是野生型T wO S C 1产量的1.2 7倍;突变体I 2 5 9 A、I 2 5 9 E、I 2 5 9 K、I 2 5 9 M、I 2 5 9 R无催化活性,但突变体T wO S C 1 I 2 5 9 E合成-香树脂醇的专一性较高,是野生型T wO S C 1产量的5倍。研究初步探索了5个关键氨基酸残基位点对T wO S C 1催化活性及产物专一性的影响,为后续深入探究T wO S C 1关键氨基酸位点提供了有价值的参考。中图分类号:Q 8 1 4 文献标识码:A木栓酮(F r i e d e l i n)又称为无羁萜或软木三萜酮,是广泛分布于自然界中的植物次级代谢产物,是植物体内一种重 要 的 木 栓 烷 型 五 环 三 萜 类 化 合 物。木 栓 酮 在 雷 公 藤(T r i p t e r y g i u m w i l f o r d i i)、刺 叶 美 登 木(M a y t e n u s i l i c i f o l i a)、大叶落地生根(K a l a n c h o ed a i g r e m o n t i a n a)等多种药用植物的树叶、树皮和树根中含量丰富1-3,具有非常重要的生理和药理学活性,例如抗肿瘤、抗氧化、消炎抗菌、降低血糖、清除体内自由基、增强机体免疫力以及保肝护肝等多种功效,被广泛应用于医药卫生、食品保健和工农业生产等领域4-5。此外,木栓酮还具有除草杀虫的作用,可以应用于植物保护6。虽然植物提取和化学合成都可以获得木栓酮,但是依然存在提取效率低、生长周期长、污染生态环境等缺点,G a o等人将来源于雷公藤的木栓酮合酶T wO S C 1引入酿酒酵母细胞中,成功构建了木栓酮的从头合成体系,通过构建酿酒酵母工程菌使木栓酮产量达到6 3.9 1m g/L,但产量依然较低,无法满足工业化生产的要求7-8。由于T wO S C 1是一种多功能合酶,不仅能够催化(3 S)-2,3-氧化鲨烯环化生成木栓酮,还能生成-香树脂醇和-香树脂醇等副产物,严重影响了酿酒酵母工程菌中木栓酮的产量。通过理性和半理性设计分析T wO S C 1的关键氨基酸残基位点,利用蛋白质工程对其关键氨基酸位点进行改造,提高T wO S C 1的催化活性及产物专一性,对提高酿酒酵母中木栓酮的产量具有重要意义。Y u等在提高-香树脂醇合酶M d O S C 1催化活性的研究中,将靠近N末端氨基酸残基N 1 1突变成N 1 1 I,-香树脂醇的产量提高了大约6倍,表明N端第1 1位氨基酸对M d O S C 1的活性具有明显影响9。M a z z e u等对来源于美登木的木栓酮合酶(M i F R S)M 5 4 9进行了研究,突变体M 5 4 9 S的催化活性显著提高,木栓酮的产量增加了2倍,但在产物中检测到了-香树脂醇和-香树脂醇,该突变体影响了M i F R S的产物专一性1 0。此外,(3 S)-2,3-氧化鲨烯环化酶(O S C)具有保守区域2 5 9 XWC Y C R 2 6 4,这一序列决定了(3 S)-2,3-氧化鲨烯的折叠模式和产物类型1 1。根据O S C基因家族的保守性及T wO S C 1序列分析,该项研究初步筛选了5个氨基酸残基位点(N 1 1、I 2 5 9、G 2 8 0、I 5 4 8、M 5 5 2),利用蛋白质工程构建了1 6个T wO S C 1突变体,分析了各个突变体对木栓酮合酶T wO S C 1催化活性及产物专一性的影响,为后续深入探究T wO S C 1关键氨基酸位点提供了有价值的参考资料。1材料与方法1.1 菌株与培养基酿酒酵母菌株a AM 2(以酿酒酵母I NV S c 1为底盘宿主,分别在其基因组的r D NA位点和D e l t a位点整合P A L A 1-E R G 2 0_P G PM 1-E R G 9_P T Y S 1-E R G 1_H I S 3以及P T DH 3-t HMG 1_P A DH 1-D GA 1_L E U 2)1 2,酿酒酵母质粒p E S C-T r p均由本实验室保存。酵母培养基(固体培养基加入2 0g琼脂粉):Y P D培养基(1L):超纯水9 5 0m L、蛋白胨2 0g、酵母提取物1 0g;S D培养基(1L):超纯水9 5 0m L、YN B6.7g、必需氨基酸0.6g、组氨酸2 0m g、亮氨酸1 0 0m g、尿嘧啶2 0m g、色氨酸2 0m g、用2M的N a OH调至p H为6.2。高压灭菌:1 2 1,2 0m i n,并加入5 0m L经1 1 5高压灭菌1 5m i n的4 0%葡萄糖溶液。大肠杆菌L B培养基(固体培养基加入琼脂1 52 0g):超纯水10 0 0m L、酵母提取物5g、蛋白胨1 0g、N a C l 5g、p H7.47.6,高压灭菌:1 2 1,2 0m i n。氨苄青霉素的使用浓度1 0 0g/m L。1.2 主要试剂与仪器质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶D NA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司、p r i m es t a rH SD NA聚合酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司、大肠杆菌T o p 1 0感受态购自上海昂羽生物技术有限公司、限制性核酸内切酶购自赛默飞世尔科技公司、木栓酮标准品、-香树脂醇标准品、-香树脂醇标准品购自北京索莱宝科技有限公司。P C R基因扩增仪(E p p e n d o r f)、电泳仪(J Y 6 0 0 E)、凝胶快速成像仪(J Y 0 2 G)、微量核酸蛋白浓度测定仪(N a n o D r o pO n e/O n e C)、安捷伦7 0 0 0 D三重四极杆气质联用仪G C/M S气相色谱质谱联用仪(G C-M S)。1.3 雷公藤T wO S C 1全长基因的克隆从N C B I数据库下载来源于雷公藤T wO S C 1的全长基因序列,并对其进行密码子优化(h t t p:/www.f r i e n d b i o.c o m/c o d o n.h t m l)和组装设计(h t t p:/5 4.2 3 5.2 5 4.9 5/g d/)。利用S O E-P C R设计引物经过多轮P C R反应以扩增出全长T wO S C 1基因片段。(1)将T wO S C 1全长序列(22 9 8b p)分为3个片段,每个片段设计2 4条引物,大约7 5 0b p碱基。片段1引物:0 1.0 0 1-0 1.0 2 4;片段2引物:0 2.0 0 1-0 2.0 2 4;片段3引物:0 3.0 0 1-0 3.0 2 4。(2)分别将各个片段包含的2 4条引物每条取1 0L于1.5m LE P管中混合均匀,进行第一轮无模板降落P C R,将各个引物片段连接起来。3个片段皆按照此方法。P C R反应体系:2m i x1 2.5L、混合引物5L、d d H2O7.5L,反应条件:9 5 2 m i n、9 5 2 0s、6 90.5/循环3 0s、7 2 1 m i n、7 25m i n、4保存(第2步到第4步循环3 0次)。(3)利用第一轮无模板降落P C R的产物为模板,每段片段的首尾引物作为上下游引物进行第二轮P C R扩增,P C R反应结束后利用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳,通过凝胶成像仪检测条带大小及亮度。利用琼脂糖D NA凝胶回收试剂盒回收目的片段,N a n o D r o pO n e检测各个回收片段浓度,-2 0 保存。P C R反应体系:2m i x1 2.5L、第一轮P C R产物2.5L、上游引物1L、下游产物1L、d d H2O8L,反应条件:9 52m i n、9 52 0s、5 63 0s、7 2 1m i n、7 2 5m i n、4 保存(第2步到第4步循环3 0111 第3期 张凯月,等:木栓酮合酶T wO S C 1的产物异构化研究次)。(4)第二轮胶回收产物为模板,以第一个片段和第三个片段的首尾引物为上下游引物进行P C R扩增全长片段。电泳并胶回收后测量浓度,-2 0 保存。P C R反应体系:2m i x1 2.5L、第二轮P C R产物各1.5L、上游引物1L、下游产物1L、d d H2O6L,反应条件:9 5 2m i n、9 5 2 0s、5 6 3 0s、7 22m i n 1 5s、7 25m i n、4保存(第2步到第4步循环3 0次)。1.4 T wO S C 1表达载体及突变体的构建经过S O E-P C R获得的T wO S C 1全长序列为模板,用带有B a mH 1和X h o 1酶切位点的引物扩增T wO S C 1,电泳后胶回收,与载体质粒p E S C-T r p用上述限制性核酸酶切酶分别3 7酶切2h和1h。酶切后的T wO S C 1和p E S C-T r p电泳后胶回收,测定浓度后用T 4连接酶连接(1 6,2h),连接产物转化至大肠杆菌T o p 1 0感受态细胞,用带有Am p抗性的L B固体培养基筛选成功转化的单菌落。摇菌后提质粒,并验证所得序列是否正确。利用A u t od o c k对T wO S C 1蛋白与(3 S)-2,3-氧化鲨烯进行分子对接(见图1),通过理性与半理性确定突变位点,设计引物(见表1),以p E S C-T r p-T wO S C 1为模板,进行P C R扩增,电泳并胶回收后,3 7条件下使用D p n 1酶消化1h,以消除模板干扰,随后转化至大肠杆菌T o p 1 0感受态细胞,用带有Am p抗性的L B固体培养基筛选成功转化的单菌落。摇菌后提质粒,并验证预测位点是否突变。图1 T wO S C 1与(3 S)-2,3-氧化鲨烯分子对接表1 构建T wO S C 1突变体的引物序列引物名称序列突变体引物名称序列突变体Y Y 0 1a a g a g a t t c g t t C A C c c a a t c a c t c c a t t gG 2 8 0 HY Y 1 7g g t g a a t g g a t g g a a T T G t t g a a c c c a a t g g a a t t cI 5 4 8 LY Y 0 2G T G a a c g a a t c t c t t a c c g t a c a a gG 2 8 0 HY Y 1 8C AA t t c c a t c c a t t c a c c a g c t c t a a c t g g t t c cI 5 4 8 LY Y 0 3a a g a g a t t c g t t C C A c c a a t c a c t c c a t t gG 2 8 0 PY Y 1 9g g t g a a t g g a t g g a a T G G t t g a a c c c a a t g g a a t t cI 5 4 8WY Y 0 4T G G a a c g a a t c t c t t a c c g t a c a a gG 2 8 0 PY Y 2 0C C A t t c c a t c c a t t c a c c a g c t c t a a c t g g t t c cI 5 4 8WY Y 0 5a a g a g a t t c g t t T C T c c a a t c a c t c c a t t gG 2 8 0 SY Y 2 1c a c c c a g c t a a g G C T t g g t g t t a c t g t a g a a t gI 2 5 9 AY Y 0 6A GA a a c g a a t c t c t t a c c g t a c a a gG 2 8 0 SY Y 2 2A G C c t t a g c t g g g t g g a t t g g c a a gI 2 5 9 AY Y 0 7g c t g a a a g a g g t A T C g c t c c a t a c t c t gN 1 1 IY Y 2 3c a c c c a g c t a a g GAA t g g t g t t a c t g t a g a a t gI 2 5 9 EY Y 0 8GA T a c c t c t t t c a g c a a c c t t c a a cN 1 1 IYY 2 4T T C c t t a g c t g g g t g g a t t g g c a a gI 2 5 9 EY Y 0 9g c t g a a a g a g g t G C T g c t c c a t a c t c t gN 1 1 AY Y 2 5g a c c c a g c t a a g AA G t g g t g t t a c t g t a g a a t gI 2 5 9 KY Y 1 0A G C a c c t c t t t c a g c a a c c t t c a a cN 1 1 AY Y 2 6C T T c t t a g c t g g g t g g a t t g g c a a gI 2 5 9 KY Y 1 1g c t g a a a g a g g t T G G g c t c c a t a c t c t gN 1 1WY Y 2 7c a c c c a g c t a a g A T G t g g t g t t a c t g t a g a a t gI 2 5 9 MY Y 1 2C C A a c c t c t t t c a g c a a c c t t c a a cN 1 1WY Y 2 8C A T c t t a g c t g g g t g g a t t g g c a a gI 2 5 9 MY Y 1 3g c t g a a a g a g g t A GA g c t c c a t a c t c t gN 1 1 RY Y 2 9c a c c c a g c t a a g A GA t g g t g t t a c t g t a g a a t gI 2 5 9 RY Y 1 4T C T a c c t c t t t c a g c a a c c t t c a a cN 1 1 RY Y 3 0T C T c t t a g c t g g g t g g a t t g g c a a gI 2 5 9 RY Y 1 5g c t g a a a g a g g t T T C g c t c c a t a c t c t gN 1 1 FY Y 3 1a t c t t g a a c c c a T C T g a a t t c t t g g a a a a c a t cM 5 5 2 SY Y 1 6GAA a c c t c t t t c a g c a a c c t t c a a cN 1 1 FY Y 3 2A GA t g g g t t c a a g a t t t c c a t c cM 5 5 2 S211 华北理工大学学报(自然科学版)第4 5卷 1.5 T wO S C 1及其突变体在酿酒酵母中的表达及G C-M S检测产物采用标准醋酸锂转化方法进行酵母转化。将测序正确的重组质粒p E S C-T r p-T wO S C 1转化到酿酒酵母a AM 2,在含终浓度2%葡萄糖的S D-T r p固体培养基3 0培养2d,挑选单菌落转接至S D-H i s-L e u-T r p液体培养基中3 0,2 0 0r p m培养2d,换终浓度2%的半乳糖的S D-H i s-L e u-T r p培养基继续在3 0、2 0 0r p m条件下诱导基因表达,2d后将菌液离心(40 0 0r p m,3m i n),倒掉上清收集菌块。取2 0%KOH于菌块中涡旋混匀以裂解细胞,1 0 0沸水浴1 0m i n,放至室温,加入正己烷涡旋萃取1 0m i n后静置2m i n,吸取上清,蒸发浓缩(13 0 0r p m,6 0)至完全干燥,加入烷基化试剂(吡啶和三甲基硅基各1 0 0L),8 0 水浴3 0m i n进行烷基化,放至室温,离心取上清。G C-M S检测分析产物,温度以2 0/m i n的速率从8 0 上升到3 0 0,并保持3 0m i n。2结果与讨论2.1 雷公藤O S C 1(T wO S C 1)的克隆及酿酒酵母表达T wO S C 1含有7 6 3个氨基酸,根据酿酒酵母偏好的密码子对该序列进行了优化,通过S O E-P C R首先获得3个约7 5 0b p的片段,使用引物0 1.0 0 1和0 3.0 2 4将3个片段组装得到T wO S C 1全长序列,22 9 8b p(见图2)。图2 T wO S C 1基因的克隆T wO S C 1基因与酿酒酵母表达载体p E S C-T r p经B a mH 1和X h o 1双酶切,并用T 4连接酶连接构建重组质粒p E S C-T r p-T wO S C 1(见图3),T wO S C 1序列经测序验证组装正确并顺利插入到表达载体中。图3 p E S C-T r p-T wO S C 1311 第3期 张凯月,等:木栓酮合酶T wO S C 1的产物异构化研究采用标准醋酸锂转化法,将p E S C-T r p-T wO S C 1转化至酿酒酵母a AM 2中,在营养缺陷型培养基S D-H i s-L e u-T r p上筛选出成功转化的菌株。发酵培养过程中加入半乳糖诱导基因表达,利用正己烷萃取酿酒酵母工程菌中的合成代谢产物,烷基化后通过G C-M S检测到木栓酮、-香树脂醇和-香树脂醇(见图4)。图4 含p YY G-T r p-T wO S C 1的酵母菌菌株产物的气相色谱-质谱(G C-M S)分析图5 突变质粒琼脂糖凝胶电泳图411 华北理工大学学报(自然科学版)第4 5卷 2.2 T wO S C 1突变体质粒的构建以p YY G-T r p-T wO S C 1为模板,根据设计的突变引物,进行P C R扩增,获得定点突变的p YY G-T r p-T wO S C 1全长序列,d p n I将模板消化后,转化至大肠杆菌t o p 1 0感受态细胞中,在含有Am p终浓度为1 0 0g/m L的L B固体培养基筛选,最终获得1 6个突变质粒(见图5),并将测序结果与野生型T wO S C 1序列比对确定设计的位点已经成功突变。2.3 T wO S C 1突变体在酿酒酵母中的表达2.3.1木栓酮的产量突变质粒转化至酿酒酵母细胞后,在S D-H i s-L e u-T r p营养缺陷型固体培养基上筛选,经过液体培养基发酵培养和基因诱导表达后,利用G C-M S测定木栓酮的产量见图6。结果表明突变体G 2 8 0 P、G 2 8 0 S、G 2 8 0 H和M 5 5 2 S中木栓酮产量高于野生型T wO S C 1,显著提高了T wO S C 1的催化活性,其中G 2 8 0 H催化活性最高,木栓酮产量为2 6.1m g/L,是野生型产量的1.2 7倍;突变体N 1 1 I、N 1 1W、N 1 1 F、N 1 1 R、N 1 1 A、I 5 4 8 L和I 5 4 8W的木栓酮产量低于野生型T wO S C 1,降低了T wO S C 1的催化活性;突变体I 2 5 9 A、I 2 5 9 E、I 2 5 9 K、I 2 5 9 M、I 2 5 9 R中未检测到木栓酮,无催化活性(见图6)。T wO S C 1的G 2 8 0位和M 5 5 2位氨基酸残基的突变可能会提高T wO S C 1的活性,而N 1 1位氨基酸残基的突变会降低T wO S C 1的活性,I 2 5 9位氨基酸残基的突变导致其无催化活性。图6 突变体在a AM 2中的木栓酮产量2.3.2酿酒酵母中突变体的产物变化T wO S C 1是一种以木栓酮为主要产物,-香树脂醇、-香树脂醇为副产物的多功能合酶。分别将其G 2 8 0、N 1 1、I 5 4 8、I 2 5 9、M 5 5 2突变后,木栓酮、-香树脂醇和-香树脂醇的产量随之发生变化。以野生型(WT)T wO S C 1作为参照,3种产物的变化如图7所示。与T wO S C 1相比,突变体G 2 8 0 P的3种产物无明显变化;突变体G 2 8 0 S和G 2 8 0 H随着木栓酮产量的提高,-香树脂醇和-香树脂醇的产量也高于野生型。N 1 1位突变后木栓酮产量均低于野生型,-香树脂醇产量均明显高于野生型;突变体N 1 1 I、N 1 1W、N 1 1 A的-香树脂醇产量略低于野生型,但N 1 1 F和N 1 1 R的-香树脂醇明显高于野生型,其中N 1 1 R是1 6个突变体511 第3期 张凯月,等:木栓酮合酶T wO S C 1的产物异构化研究中-香树脂醇和-香树脂醇产量最高的突变体,且3种产物产量差异不大。I 5 4 8位突变后,木栓酮产量均低于野生型,但-香树脂醇和-香树脂醇的产量均高于野生型。I 2 5 9位突变之后,该酶完全丧失合成木栓酮的能力,且-香树脂醇的产量显著降低,但I 2 5 9 E催化合成-香树脂醇的活性显著提高,约为野生型的5倍。突变体M 5 5 2 S同时提高了木栓酮、-香树脂醇和-香树脂醇的产量,且3种产物的产量比接近2:1:1,与野生型相比,该突变体降低了T wO S C 1产物合成木栓酮的专一性。图7 T wO S C 1突变体在a AM 2中的产物变化第1 1位氨基酸与第5 4 8位氨基酸的突变降低了木栓酮的产量,但2种香树脂醇的总产量明显提高,表明这些氨基酸残基位点的突变可能影响了底物折叠过程中正电荷的迁移1 3,促使更多的(3 S)-2,3-氧化鲨烯环化合成香树脂醇。第2 8 0位和5 5 2位氨基酸残基突变后,3种产物产量同时增加,表明这2个氨基酸残基位点的突变能够增强底物与T wO S C 1的亲和力,进而提高其催化活性。I 2 5 9位氨基酸残基位于O S C保守基序2 5 9 XWC Y C R 2 6 4中,T wO S C 1的第2 5 9位氨基酸残基与来源于大叶落地生根中的木栓酮合酶K d-F R S1、山杨(P o p u l u sd a v i d i a n a)中的木栓酮合酶P d F R S1 4和刺叶美登木中的木栓酮合酶M i F R S1 5的第2 5 9位氨基酸残基不同,将T wO S C 1的第2 5 9位突变后,所有突变体丧失了合成木栓酮的活性,但突变体T wO S C 1 I 2 5 9 E合成-香树脂醇的专一性显著提高,这与2 5 9 XWC Y C R 2 6 4保守基序可能与产物的特异性有关的推测一致1 1,1 6,因此T wO S C 1的I 2 5 9位对木栓酮的合成具有重要意义。此外,推测这些突变的氨基酸残基位于T wO S C 1的活性中心通道附近(见图1),其极性与所带电荷影响着(3 S)-2,3-氧化鲨烯进入活性中心的能力及与T wO S C 1的亲和力,进而影响着T wO S C 1的催化活性。为了实现木栓酮的工业化生产,不仅要提高突变体的催化活性,还要提高其特异性,因此仍需探索更多的T wO S C 1关键氨基酸位点,获得催化活性高且产物专一性强的T wO S C 1突变体。3结论(1)研究初步探索了T wO S C 1的5个关键氨基酸残基位点,构建了1 6个突变体。(2)1 6个突变体转化至酿酒酵母中,通过G C-M S分析,筛选出木栓酮合酶突变体T wO S C 1 G 2 8 0 H的催化活性最高,突变体T wO S C 1 I 2 5 9 E对-香树脂醇的产物专一性最高。(3)研究为后续深入探究木栓酮合酶T wO S C 1的关键氨基酸位点提供了一定的参考价值。611 华北理工大学学报(自然科学版)第4 5卷 参考文献:1 WAN GZ,Y E A T ST,HANH,e t a l.C l o n i n ga n d c h a r a c t e r i z a t i o no f o x i d o s q u a l e n e c y c l a s e s f r o mK a l a n c h o e d a i g r e m o n t i a n a:e n z y m e sc a t a l y z i n gu pt o1 0r e a r r a n g e m e n ts t e p sy i e l d i n gf r i e d e l i na n do t h e rt r i t e r p e n o i d sJ.T h eJ o u r n a lo fb i o l o g i c a lc h e m i s t r y,2 0 1 0,2 8 5(3 9):2 9 7 0 3-2 9 7 1 2.2 VAN MAA R S E V E E N C,J E T T E R R.C o m p o s i t i o no ft h ee p i c u t i c u l a ra n di n t r a c u t i c u l a rw a xl a y e r so nK a l a n c h o ed a i g r e m o n t i a n a(H a m e t e tP e r r.d e l aB a t h i e)l e a v e sJ.P h y t o c h e m i s t r y,2 0 0 9,7 0(7):8 9 9-9 0 6.3 L IP,S HE NSX,L I ULX,e ta l.An e wd e m e t h y l a b i e t a n ed i t e r p e n o i d f r o mt h e r o o t so fT r i p t e r y g i u mw i l f o r d i iJ.N a t u r a l p r o d u c tr e s e a r c h,2 0 2 0,3 4(2 1):3 0 9 4-3 1 0 0.4 V I S TU B AJ P,P I OV E Z AN M,P I Z Z O L AT T IMG,e t a l.I n c r e a s i n g t h e i n s t r u m e n t a l t h r o u g h p u t o f g a s c h r o m a t o g r a p h ym e t h o du s i n gm u l t i p l e i n j e c t i o n s i na s i n g l e e x p e r i m e n t a l r u n:A p p l i c a t i o n i nd e t e r m i n a t i o no f f r i e d e l a n-3-o l a n d f r i e d e l i n i nM a y t e n u s i l i c i f o l i aJ.J o u r-n a l o fC h r o m a t o g r a p h yA,2 0 1 3,1 2 7 4:1 5 9-1 6 4.5 L E EJA,HASK,K I M YC,e t a l.E f f e c t so f f r i e d e l i no n t h e i n t e s t i n a l p e r m e a b i l i t ya n db i o a v a i l a b i l i t yo f a p i g e n i nJ.P h a r m a c o l o g i-c a l r e p o r t s:P R,2 0 1 7,6 9(5):1 0 4 4-1 0 4 8.6 L I MAN M,D EMA R QU I SR,AN D R A D ET,e t a l.P h y t o c h e m i c a l,m e t a b o l i c p r o f i l i n ga n da n t i p a r a s i t i c p o t e n t i a l f r o mI n g a s e m i a l a-t a l e a v e s(F a b a c e a e)J.N a t u r a l p r o d u c t r e s e a r c h,2 0 2 0,3 6(7):1-6.7 Z HOUJ,HUT,GAOL,e t a l.F r i e d e l a n e-t y p e t r i t e r p e n e c y c l a s e i nc e l a s t r o l b i o s y n t h e s i s f r o mT r i p t e r y g i u mw i l f o r d i i a n d i t s a p p l i c a-t i o nf o r t r i t e r p e n e sb i o s y n t h e s i s i ny e a s tJ.T h eN e wP h y t o l o g i s t,2 0 1 9,2 2 3(2):7 2 2-7 3 5.8 GAO HY,Z HAO H,HUT Y,e t a l.M e t a b o l i cE n g i n e e r i n go f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e f o rH i g h-L e v e lF r i e d e l i nv i aG e n e t i cM a n i p u-l a t i o n.F r o n t i e r s i nB i o e n g i n e e r i n ga n dB i o t e c h n o l o g y.2 0 2 2,1 0:8 0 5 4 2 9.9 YUY,RA S OO LA,L I U H,e t a l.E n g i n e e r i n gS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e f o rh i g hy i e l dp r o d u c t i o no f -a m y r i nv i a s y n e r g i s t i c r e m o d e-l i n go f -a m y r i ns y n t h a s ea n de x p a n d i n gt h es t o r a g ep o o lJ.M e t a b o l i cE n g i n e e r i n g,2 0 2 0,6 2:7 2-8 3.1 0 MA Z Z E UB F,S OU Z A-MO R E I R ATM,O L I V E I RA AA,e ta l.T h eM e t h i o n i n e5 4 9a n dL e u c i n e5 5 2r e s i d u e so f f r i e d e l i ns y n t h a s ef r o m M a y t e n u s i l i c i f o l i aa r e i m p o r t a n t f o r s u b s t r a t eb i n d i n gs p e c i f i c i t yJ.M o l e c u l e s,2 0 2 1,2 6(2 2):6 8 0 6.1 1 S A LMON M,TH I MMA P P AR B,M I NT OR E,e t a l.Ac o n s e r v e da m i n oa c i dr e s i d u ec r i t i c a l f o rp r o d u c ta n ds u b s t r a t es p e c i f i c i t yi np l a n t t r i t e r p e n e s y n t h a s e s.P r o c e e d i n g so f t h eN a t i o n a lA c a d e m yo f S c i e n c e so f t h eU n i t e dS t a t e so fAm e r i c a.2 0 1 6;1 1 3(3 0):E 4 4 0 7-4 4 1 4.1 2 YUY,C HAN GP,YUH,e t a l.P r o d u c t i v eAm y r i nS y n t h a s e s f o rE f f i c i e n t -Am y r i nS y n t h e s i s i nE n g i n e e r e dS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i-a eJ.A C SS y n