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第7章蛋白质的分离纯化和表征
第七章 蛋白质的分离纯化和表征
第一节 蛋白质的酸碱性质
各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同.
等电点要用等电聚焦等方法测定。

第二节 蛋白质分子的大小与形状
一、根据化学组成测定最低相对分子质量
假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。
若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时,可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数.
例题：一种纯酶含亮氨酸(Mr 131)1。65％，含异亮氨酸(Mr131)2。48%,求最低相对分子质量。
解：按照Leu 的百分含量计算最低Mr X1:
X1=（100´ 131）/1。65=7939.4。
按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2：
X2=(100´ 131）/2。48=5282。3。
由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个,为了估算Leu 和Ile 的个数,首先计算:
X1/X2=7939。4/5282。3≈1。5。
这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为:
7939.4 ´2 =15878.8 或5282。3×3=15846。9。
二、渗透压法测定相对分子质量

三、沉降分析法测定相对分子质量

基本原理：
（一）离心力(centrifugal force，Fc）
当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义：
F=m·a=m·ω2 r
a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r-粒子的旋转半径（cm）。
（二）相对离心力（relative centrifugal force，RCF）
由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变,一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果.
RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

X 为离心转子的半径距离，以cm 为单位；g 为地球重力加速度（980cm/sec2)；n 为转子每分钟的转数(revolutions per minute,简写成r/min，或rpm)。
（三）沉降系数(sedimentation coefficient，s)
根据1924 年Svedberg 对沉降系数下的定义,颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。
X1:离心前粒子离旋转轴的距离；X2：离心后粒子离旋转轴的距离.S:时常在10—13秒左右，故把沉降系数10—13秒称为一个Svedberg 单位，简写S，量纲为秒。
例如,动物原生质核糖体的沉降系数等于80S，它的含义就是：80×10—13s。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开。
（四）沉降速度(sedimentation velocity)
对于球形颗粒：
Fc=1/6Πd3(ρp−ρm)ω2X；Ff=3Πηdv
当Fc=Ff时，1/6Πd3(ρp−ρm)ω2X=3Πηdv。
v=(1/18η)［d2(ρp−ρm）ω2X］

（五）沉降系数与物质相对分子质量
由沉降系数根据Svedberg 公式可以计算出物质的相对分子质量：
Mr=RTS20,W/[D20，W(1-γρ）］
Mr：相对分子质量；D20，W：以20℃的水为介质时颗粒的扩散系数；R:气体常数；T：绝对温度;
S20，W：以20℃的水为介质时颗粒的沉降系数；γ：偏比容，等于溶质粒子密度的倒数；ρ：溶剂密度。
(六)沉降时间（sedimentation time，Ts）
在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这
就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子
所需的时间.根据沉降系数（S）式可得

X2：离心转轴至离心管底内壁的距离；X1：离心转轴至样品溶液面之间的距离，那么（t2－t1）用Ts表示：

（七)K 系数（k factor)
K 系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。也就是使溶液澄清的一个指数，所以也叫“cleaning factor”.原则上，K 系数愈小将粒子沉降得速度愈快。

由其公式可知，K 系数与离心转速及粒子沉降的路径有关。所以K 系数是一个变数。
通常,离心机的转子说明书中提供的K 系数，都是根据最大路径及在最大转速下所计算出来的数值.
利用此公式预估的离心时间,对水平式转子最适合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间来得快些。

四、凝胶过滤法测定相对分子质量
当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱.而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。
若以组分的洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量的对数（lgMr）作图,可得一曲线，其中主要部分成直线关系.以此为标准曲线,可以通过测定某一未知组分的洗脱体积,而从标准曲线中查得其相对分子质量。
在实际应用中多以相对洗脱体积Kav （Kav=Ve/Vt) 对lgMr 作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型的化合物,如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子质量的组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验。

五、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量
SDS 即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂,在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团的浓度与SDS 总浓度、离子强度及温度有关，为了使单体和蛋白质结合生成蛋白质-SDS 复合物,需要采取低离子强度，使单体浓度有所升高。在单体浓度为0。5m mol/L 以上时，蛋白质和SDS 就能结合成复
合物;当SDS 单体浓度大于1m mol/L 时,与大多数蛋白质平均结合比为1.4g SDS/g 蛋白质;在低于0.5mmol/L 浓度时,其结合比一般为0。4gSDS/g 蛋白质。由于SDS 带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异,使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr 差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中,加入SDS和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。SDS 可使蛋白质的氢键、疏水键打开,还引起蛋白质构象的改变。此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状
近似雪茄形的长椭圆棒.不同蛋白质—SDS 复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr 成正比。
目前,用SDS—PAGE 研究过的蛋白质已有数百种，均证实此法测定蛋白质Mr 的可靠性。现在,市场有标准蛋白试剂出售。测定未知蛋白质Mr 时,可选用相应的一组标准蛋白及适宜的凝胶浓度,同时进行SDS-PAGE，则可根据已知Mr 蛋白质的电泳迁移率和Mr 的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得Mr.本方法有仪器设备简单，操作方便，样品用量少，耗时少（仅需一天），分辨率高，重复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展。它不仅用于蛋白质Mr 测定,还可用于蛋白混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE 分离后,设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究.

第三节 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
一、蛋白质的胶体性质
大小在1-100nm 范围内；
同种电荷互相排斥；
质点外围有水化层。
二、蛋白质的沉淀
盐析法;
有机溶剂沉淀法；
重金属盐沉淀法;
生物碱试剂和某些酸类沉淀法；
加热变性沉淀法.
第四节 蛋白质分离纯化的一般原则
一、前处理
要选择合适的材料；合适的破碎方法；合适的提取液。
二、粗分级分离
要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。
三、细分级分离
主要使用各种层析、电泳,方法要精心选择，巧妙配合.后期可用结晶法。
第五节 蛋白质的分离纯化方法（一）
一、根据分子大小不同的纯化方法
(一）透析和超滤
1．透析
透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液(蒸馏水或缓冲液)中进行的，透析液可以更换,直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。
原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。

2．超滤
利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。
超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等.超滤法是一种温和、非变性的物理方法，比其它分离方法有效率更高、更灵活的优点。
原理：
在外力作用下，超滤膜对大分子物质的截留主要是筛分作用,决定截留效果的主要是膜的表面活性层上孔的大小与形状.除了筛分作用外，膜表面、微孔内的吸附和粒子在膜孔中的滞留也使大分子被截留。
现在已有各种市售的超滤膜装置可供选用，有加压、抽滤和离心等多种形式。滤膜也有多种规格，他们截留相对分子质量不同的蛋白质。使用中最需注意的问题是滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，使超滤速度减慢,能被截留物质的Mr 变小。

超滤的主要应用：
浓缩:使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。

梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法，适用于分离分子量相差10 倍以上的分子组分.在超滤过程中,虽然截留的大分子被浓缩，但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度.

脱盐／纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。通过溶剂交换，可最有效地去除溶液中的小分子物质,并逐渐分离纯化出大分子物质.具体方法为：在溶液进行超滤的同时，不断向溶液中补充溶剂，补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同，使体系始终保持恒定，这种方法又称透析超滤法。

(二）密度梯度离心

（三）凝胶过滤
当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大,不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱.而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中,向下移动的速度较慢,从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

样品中各组分的流出顺序，可用分配系统Ka 来量度：
Ka=（Ve—Vo）/Vi 􎀃式中Ve：为洗脱体积(elution volume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时,所需的洗脱液体积;Vo：外体积(outer volume），为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积。
Vi：内体积（inner volume）,为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。
当某组分的Ka=0 时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出。
若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时,说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时,最后流出.
Ka 在0-1 之间的组分，洗脱时Ka 值小的先流出 ，Ka 值大的后流出。

二、利用溶解度差别的纯化方法
（一）等电点沉淀和pH 控制
利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。
在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力,但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全,所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用.
单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH 的过程中,要一边搅拌一边慢慢加入,以防止局部过酸或过碱。
（二）蛋白质的盐溶和盐析
定义:一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加,这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后,蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同,借此可达到彼此分离的目的.
原理：盐浓度增高到一定数值后,水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。

盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系.两者的关系可用下式表示：
lg（S/So)=-KsI
S 为蛋白质在离子强度为I 时的溶解度(g/L）;So 为蛋白质在离子强度为0 时的溶解度；Ks 为盐析常数；
I 为离子强度。
在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH 值的水溶液中的溶解度为一常数So.故上式可改写为：lgS=lgSo–KsI=β–KsI β=lgSo 为一常数。
β值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH 值有关；盐析常数Ks 主要与盐的性质（离子价数、平均半径等）和蛋白质的结构有关，Ks 越大盐析效果越好。
所以对某一蛋白质来说，在温度和pH 值等盐析条件确定（即β确定），所采用的盐确定（即Ks 确定）以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I，I 可用下式计算：
I=1/2ΣmiZi2
mi：溶液中离子的摩尔浓度。
Zi：离子的价数。
对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。
盐的选择：
蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵.
硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。
硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小(25℃时溶解度为4.1mol/L,即767g/L；0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L）,而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。
但是用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析.磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks 较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛.
硫酸铵浓度的计算与调整方法：
通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示（不是浓度百分比），例如大部分蛋白质可在80％ 硫酸銨饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，曾改变最后的总体积，很难由浓度百分比來计算,因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。
用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种：
1．加入饱和溶液法
要求：蛋白质溶液体积不大,所需调整的硫酸铵浓度不高。
V=V0（S2-S1）/(1-S2)
V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。
饱和硫酸铵的配制方法:在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2 天，有固体析出时达100％饱和度。
2．加入固体盐法
要求：饱和度高,不增大溶液体积。
t=G（S2-S1)/(1-AS2)
S2，S1：分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t:将1L S1 饱和度的溶液提高到S2 饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G，A：常数，与温度有关。
实际使用时，t 可直接查表得到。（注意：0℃，25℃两张表,室温用25℃)
(三）pH 和温度对蛋白质溶解度的影响
pH 的影响：
大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低.所以盐析时溶液pH 值调到等电点效果最好。

温度的影响：
在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加;
在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低.
一般在室温下进行盐析；温度敏感的蛋白质在低温4℃进行；也有个别酶在低温时失活，高温有活性，如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25℃比0℃时溶解度低，更容易盐析.

（四）有机溶剂分级分离法
1．作用机理
降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；
破坏大分子周围水膜,使溶解度降低.
利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。
2．优点
比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。
3．缺点
有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性,所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解,以降低有机溶剂浓度，避免变性。
中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加0。05mol/L 的中性盐。由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度,故中性盐不宜添加太多。
有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用.即操作时溶液的pH 值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近.

注意：
低温操作。
样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大,分离效果差；过小,易产生变性,回收率低。
样品稳定结构范围内,选择溶解度最低处的pH，即与等电点共沉淀结合使用。
注意离子强度，离子种类的影响。
第六节 蛋白质的分离纯化方法（二)
三、根据电荷不同的纯化方法
（一）电泳
带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度（mobility)，可用下式表示：
U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt
式中，U（也可以用m 表示）为泳动度（cm 2/V 穝)；v 为颗粒泳动速度(cm/s）；E 为电场强度（V/cm）;
l 为支持物的有效长度(cm）；V 为实际电压（V）;t 为通电时间（s 或min）。电泳后通过侧量V,t，d，l,即可计算出被分离物质的泳动度.
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小,愈接近球形，泳动度愈大.被分离的球形分子在电场中所受的力(F）为：F=EQ。式中，E 为电场强度，即每厘米支持物的电位降，Q 为被分离物所带净电荷。
根据Stoke 定律,一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F'为：F'=6πrηv.式中,η为介质粘度，r 为分子半径，v 为分子移动速度。􎀄
当平衡时:F=F’，即EQ=6ðrçv。所以v=EQ/6ðrç，因为U=v/E，所以U=Q/6ðrç。
由上式可见泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷有关。

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N—甲叉双丙烯酰胺
（methylene-bisacrylamide,简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）。

凝胶的聚合常用过硫酸铵（AP)为催化剂,四甲基乙二胺(TEMED）为加速剂。TEMED 的碱基可催化AP 水溶液产生游离氧原子，激活Acr 单体，使其聚合成单体长链，在Bis 作用下,聚合成网状凝胶。碱性条件下凝胶易聚合，室温下7。5％的凝胶在pH8.8 时30min 聚合，在pH4.3 时约需90min。
此外，核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。

聚丙烯酰胺凝胶有下列优点:􎀄
在一定浓度时，凝胶透明，有弹性,机械性能好。􎀄
化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。􎀄
对pH 和温度变化较稳定.􎀄
几乎无电渗作用，只要Acr 纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好.􎀄
样品不易扩散,且用量少，其灵敏度可达10-6g.
凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。􎀄
分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。􎀄
PAGE 应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备， 还可测定相对分子质量、等电点等。
（三）等电聚焦
蛋白质是两性电解质，当pH＞pI 时带负电荷,在电场中向正极移动；当pH＜pI 时带正电荷,在电场中向负极移动；当pH=pI 时净电荷为零,在电场中既不向正极也不向负极移动,此时的pH 就是该蛋白质的等电点(pI)。各种蛋白质由不同的氨基酸以不同的比例组成，因而有不同的pI。利用pI 不同，以PAGE
为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier amphol ytes)，在电场作用下,两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH 梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI 的pH 处,即不再泳动而聚焦成带,这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（isoelectric focusing—PAGE，简释IEF-PAGE）。

(四）双向电泳
双向PAGE 电泳是由两种类型的PAGE 组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行
第二向电泳。如这二向电泳体系pH 及凝胶浓度完全相同，则电泳后样品中不同组分的斑点基本上呈对角
线分布，对提高分辨率作用不大。1975 年，O’Farrell 等人根据不同生物分子间等电点及相对分子质量不同的特点，建立了以第一向为IEF—PAGE，第二向为SDS—PAGE 的双向分离技术，简称为IEF/SDS—PAGE;
基本原理与IEF-PAGE，SDS—PAGE 完全相同。
一般第一向IEF—PAGE 用超薄水平板，电泳结束后切取所需泳道用于第二向电泳,或在1mm 内径的
毛细管中进行第一向IEF—PAGE，取出胶条用于第二向电泳。第一向电泳的方法同IEF-PAGE，只是制胶时要加入2%两性电解质和6mol/L 尿素。第二向电泳时,先将SDS-PAG 灌在垂直玻璃板之间，上部留2cm左右空间,待聚合后，将第一向胶条转移到第二向胶之上，用载玻片将胶条轻轻压直，加3μL 1％溴酚兰指示剂，用1%的琼脂糖(用电极缓冲液配制）密封胶条，琼脂糖凝固后即可电泳。待溴酚兰将至凝胶板下方边缘时,停止电泳。第二向电泳时，用梯度混合器将凝胶制成7。5％-15%的浓度梯度，可以提高电泳的分辨率。

（五）毛细管电泳
毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis,CGE)是在毛细管中填充具线状缠结聚合物结构的物理凝
胶，使样品中各组分通过净电荷差异和分子大小差异双重机制得以分离。CGE 在蛋白质、多肽、DNA 序列分析中得到成功应用，已成为生命科学基础和应用研究中有力的分析工具.􎀄近年来，其它类型的毛细管电色谱法（capillary electro—chromatography,CEC)发展很快。其中填充毛细管电色谱法（packed colomn CEC）是将细粒径固定相填充在毛细管柱中，开管毛细管电色谱法（open tubolarCEC）是把固定相的官能团键合在毛细管内壁表面而形成的色谱柱。CEC 是很有前途的分析方法。

(六层析聚焦
层析柱中装多缓冲交换剂，用多缓冲剂淋洗柱子可以形成pH 梯度，淋洗液按照pH 依次从柱中流出，蛋白质按pI 依次从柱中流出，有较好的分离效果。

（七)离子交换层析
1．离子交换剂
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成的，基质与电荷基因以共价键连接,电荷基因与反离子以离子键结合。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,假设以RA+代表阳离子交换剂,其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA++B+ ƒ RB++A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性（阳性）离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性（阴性）离子交换剂对OH—的结合力比对Cl-的小得多；弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大;弱碱性离子交换剂对OH—的结合力比对Cl—的大。因此，在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与各种水合离子（离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。所以，离子价数越高，结合力越大。在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力亦越大。

2．洗脱方法
在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。
梯度溶液按组成来分，一般有二种:一种是增加离子强度的梯度溶液。是用一简单的盐（如NaCl 或KCl)溶解于稀缓冲液制成的，习惯上不用弱酸或弱碱的盐类；另一种是改变pH 值的梯度溶液.该溶液是用两种不同pH 值或不同缓冲容量的缓冲液制成的，所用缓冲液的种类、pH 值以及缓冲容量要认真选择，否则将达不到预期目的。对于增加离子强度的梯度溶液,不管用于何种类型的离子交换剂,其离子强度绝大部分是增加的。而改变pH 值的梯度溶液则不然，如果使用的是阳离子交换剂，pH 值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH 值应从高到低递减，实际许可的pH 值范围由待分离物质的稳定pH 范围
和离子交换剂限制的pH 范围来决定。

四、利用选择性吸附的纯化方法
(一）羟基磷灰石层析
羟基磷灰石[Ca5(PO4）3OH2（简称HA)］的吸附容量高，稳定性好（在T＜85℃,pH5.5—10。0 均可使用),因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA 和杂合型双链DNA-RNA 等，经过一次HA 柱层析，就能达到有效的分离。
HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用.而HA的PO43—基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。
（二)疏水作用层析
以苯基琼脂糖或辛基琼脂糖为固体支持物，与蛋白质表面的疏水区相互作用，用降低离子强度或增加置换剂的反方法洗脱.常用的置换剂有非离子型去污剂、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用层析容易引起蛋白质变性，在蛋白质分离中使用不广。
五、利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法
亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。
具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有:酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA 和RNA、激素和其受体、DNA 与结合蛋白等。
在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如,酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固定相,使样品中的酶分离纯化,也可把酶作为固定相,使样品中的辅酶分离纯化.

六、高效液相层析和快速蛋白液相层析
高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC)，又称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。
HPLC 在高压下使液体通过色谱柱,在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。
（一)高压
由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多,所以必须施加高压，一般为15—30MPa,最高可达50MPa。
（二）高速
由于HPLC 采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10 分钟,比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC 稍慢。
（三）高效
由于HPLC 的柱效较高(每米塔板数可达5000），有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分.
（四）高灵敏度
采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10—9g乃至10—11g的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析.
由于HPLC 具有以上特点,所以70 年代以来得到了迅速的发展。一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点较低时,可用GC 进行分析；当沸点较高(＞450℃)、不能气化或热稳定性差者,可用HPLC 分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时,可用TLC 等经典液相色谱进行分析。
第七节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
一、蛋白质含量测定
1．凯氏定氮法
2．双缩脲法
3．酚试剂法
4．紫外吸收法
5．染料结合法
6．胶体金法
7．免疫学方法
8．生物活性测定法
二、蛋白质纯度鉴定
常用电泳法、HPLC 法、免疫学方法等。