RNA干扰设计.doc

什么是siRNA和RNAi

     双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。
    RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。

RNAi技术发展历程

1998：植物基因中基因沉默现象的发现
2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现
2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一
2003：动物体内观察到RNA干扰作用
2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展
2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND
2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND
2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果
2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破
2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家
2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估
截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验
RNAi 2006诺贝尔医学奖述评

—— 年轻的获奖者 ——
2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制， 解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。
—— RNAi的殊荣 ——
2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。
—— RNAi的机制 ——

—— RNAi的身世 ——
科学家们最早在植物(Napoli等，1990)和脉孢菌(Neurospora crassa) (Cogoni和Macino，1997)中发现了dsRNA诱导的RNA沉默现象。RNAi在这些机体中作为抗病毒的防御体系而发挥作用。虽然在上述发现中，转基因病毒可以编码具有沉默功能的基因片断，并在复制过程中产生dsRNA，但针对RNA沉默现象的决定性发现还是由Andrew Fire和Craig Mello首先完成的。早在几年前，在线虫中进行反义RNA实验时，Guo和Kemphues就观察到正义RNA也具有很高的基因沉默活性(Guo和Kemphues，1995)。后来Andrew Fire和Craig Mello通过实验阐明了这一反常现象：将反义RNA和正义RNA同时注射到秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)比单独注射反义RNA诱导基因沉默的效率高10倍。由此推断，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平(Fire等，1998)。人们将这一现象命名为RNAi (见综述：Arenz和Schepers，2003)。
基因所携带遗传信息（即单个基因的具体功能）的传递是通过名为信使RNA的分子进入细胞蛋白合成“工厂”而实现的，而基因功能的研究方法一直是研究工作的拦路虎。Fire和Mello通过线虫实验证实：某些分子触发了特定基因上RNA的破坏，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”，而这一过程便被称为RNAi。天然的RNAi现象存在于植物动物和人类等真核生物的体内，在调解基因活力和预防病毒感染方面起到重要作用。同时他们还发现了有效关闭基因表达的方法，这样当某一特定基因被“沉默”后，其功能便反向的体现出来了。
—— RNAi的运用 ——
RNAi主要通过在转录后(post-transcriptional)水平阻断基因的表达，并借此研究基因的功能。同时它为我们提供了一个治疗疾病的新途径。比如，我们可以按拟定的方式来关闭(shutting off)非必需或致病基因的功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路。
随着人们对多种生物体基因组序列了解的深入，RNAi技术可以帮助我们更细致地了解复杂的生理学过程。RNAi技术与基因组学、蛋白质组学和功能蛋白质组学密切相关，因此， RNAi本身可作为一项实验技术为生物工程及制药业等相关行业服务，从而在更深更广的领域发挥其作用。
,

RNAi技术应用前景

—— 研究基因功能的新工具 ——
RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。
—— 研究信号传导通路的新途径 ——
联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果，在此基础上分析DSH3PX1与DACK之间的关系，证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶。RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点， 因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。
—— 开展基因治疗的新策略 ——
RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。
肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。
我们应该肯定RNAi技术在充满挑战的后基因时代必将有广阔的应用前景，它将会在生物医学研究中产生一种新的技术革命。人工合成的dsRNA寡聚药物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业。

RNAi基本原理

目前对RNAi的作用机理尚不清楚， RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，属于基因转录后调控，其中需要ATP的参与。通常认为dsRNA由核酸内切酶（RNase Ⅲ）切割成21～23bp的siRNA（在果蝇RNase Ⅲ被称为 dicer），siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、螺旋酶）结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，然后RISC再特异性地与ｍRNA的同源区结合，通过酶的作用使ｍRNA降解，而产生基因沉默。靶ｍRNA被破坏后， RISC还可以再作用于其它靶分子。siRNA还具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶（PKP）的激活而使其被降解，从而大大减少了其对ｍRNA的抑制作用。
RNAi技术专用名词
         MicroRNA（miRNA，微小RNA）

一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或者干涉）。它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。
         mRNA，为 messenger RNA 的简称，或称为信使RNA

是由内源性发夹（hairpin）结构转录产物衍生而来的一种长为19nt~25nt的单链RNA。在每种高等动物中，存在200种以上的miRNA，是最大的基因家族之一，约占基因组的1%。
         siRNA：(short/small interfering RNAs)

mRNA是由DNA经由转录而来，带着相应的遗传讯息，为下一步转译成蛋白质提供所需的讯息。
小干扰RNA一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）。
         shRNAs：(RNA-Short hairpin RNAs)
短发夹RNA是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，短发夹RNA能够通过RNA干扰来抑制基因的表达。Thomas Rosenquist's group和Greg Hannon's group联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。
         cDNA：互补DNA
以信使RNA为模板合成的DNA，常常采用互补DNA的一条链作为绘制物理图谱时的探针。
         Genomic Library基因组文库
对某个染色体，制备随机产生的、相互之间有重叠部分的片段的克隆。
         RISC：（RNA-induced silencing complex）RNA诱导沉默复合物
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA(3, 18, 27, 29)。尽管切割的精确机制现在还是未知，研究表明每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。
         Dicer（DCR）：Dicer酶
RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片断的3'端都有2个碱基突出(27，28)。
         PTGS：(Post-transcriptional Gene Silencing ，PTGS)
转录后基因沉默部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的，它是相对于部分植物中发生的转录阶段的基因沉默（TGS）而言的。
         TGS：（transcriptional gene silencing）转录阶段基因沉默
         gene silence：基因沉默
研究结果发现有大量的转基因植株不能正常表达，通常这并不是由于转基因的缺失或突变引起的，而是基因失活的结果，这种失活的现象称为基因沉默。
         nt：核苷酸数
         RdPR：依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdPR）
由不同种RNA病毒进行编码，进行基因组的复制、mRNA的合成、RNA的重组和其他一些功能。目前的研究证明RdPR存在于除昆虫和哺乳动物的几乎所有真核细胞中，在RNA沉默途径中发挥重要作用。
         19+2+2 nt siRNA：
在细胞中双链RNA一般都被切割成21-23小片段，这样的RNA片段能达到更好的RNAi作用。人工合成的siRNA也是依据这个原理，所合成的RNA就是19nt的碱基序列再加上两端的识别序列如-GG，-TT等。
         SECs (siRNA expression cassettes)：siRNA表达框架
一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。
         Homologies：同源性
指同种类不同个体或者不同种类个体之间的，染色体或者蛋白质序列的相似性
         Recombinant Clone：重组克隆
将不同来源的DNA片段合成在一个DNA分子中，这种技术称为重组，得到的分子为重组克隆。
         Ribonucleic acid：核糖核酸
RNA从细胞的细胞核和细胞质部分分离出来的化学物质。在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用，RNA的结构和DNA的结构类似，都是有核苷酸按照一定顺序排列成的长链。RNA可以分为信使RNA、转运RNA、核糖体RNA以及其他类型的RNA。
         Ribosomal RNA：(核糖体RNA，简写为rRNA)
是一组存在于核糖体中的RNA分子。
         RNA blot hybridization：RNA印迹杂交
RNA印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总RNA或mRNA特定靶序列的技术。
         RNA酶控制：
在实验中前期的质粒的构建和提取是要用到RNAse A这种酶的存在会降解后期要转录生产的RNA 如果前期出现了这个酶的污染就会导致后期实验的失败，而后期转录时又要用到其他的RNA酶，如RNA 聚合酶3等，因此在实验中严格控制好RNA酶是RNA实验的关键，具体的做法是做到DNA，RNA移液器的专用，DNA实验室和RNA实验室的物品和器械分开使用，将实验室中的任务污染源减少至最低。

siRNA基本原理

    RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因，细胞中出现了dsRNA，Rde-1（RNAi缺陷基因-1）编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来。然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex （RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。
    RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。
siRNA基本特点
         长度约在22nt左右。
         结构上， siRNA是双链RNA。
         是RISC组分。
         生成需要Argonaute家族蛋白存在。
         siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。
         siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。
         依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。
         在Dicer酶的加工过程中， siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。
         在作用位置上， siRNA可作用于mRNA的任何部位。
         在作用方式上， siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。
         siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

siRNA寡聚核苷酸设计原则

    siRNA的设计是决定RNAi实验成败关键性的第一步。并非每个siRNA都能有效引发基因沉默。和引物设计一样，设计有效的siRNA也有一些经过前人经验总结出的规则，而且这些规则随着对siRNA研究的深入也在不断完善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高，3个保证中2个。
    siRNA的反义链3'端最好以UU结尾，这被公认是最有效的的siRNA结构。现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi，你可以尝试。不过如果是体外转录合成siRNA，要避免以G结尾，因为后继处理时RNase会切除末端的G。
    多个siRNA位点最好分散分布在mRNA全长上。没有数据表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特别的关系。如果siRNA位点因为mRNA二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果，分散分布可以减少风险。不过，也有报道说，如果可能，最好能避开起始的50－200个碱基，以避开潜在的调控蛋白结合位点。
    避开和其他基因同源序列，以免“误伤群众”。潜在的目标序列都到这里BLAST一下，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST，和其他基因有16个以上碱基同源的序列一定枪毙掉。
GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。有较多选择时留意，不要有连续9个以上的GC，也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章由于siRNA双链上只有一条链会结合RISC上，究竟哪条链取决于RNA解旋酶，而正义链5'端以GC开头，且5'端1－4个碱基GC含量高，且16－19位碱基GC含量低的序列,得到的siRNA反义链5'端GC含量低，3'GC含量高（也有研究表明反义链5'端前7个碱基至少有5个AU），使得反义链比较容易正确结合RISC，因而基因沉默效果比较好。
    如果是shRNA表达载体，用的是RNA聚合酶III类的启动子如U6，最适合的结构是5’GN，后面连续4个U结尾即可令转录终止，要避免序列中G，减出现连续的U/A。
如果是自行设计siRNA的话，一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNAs，平行实验以期提高成功率。据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。
siRNA设计工具

研究人员自建的设计工具，以及一些公开的siRNA信息数据库，仅供参考。
Whitehead Institute开发的工具（可以自定义你认为有用的计算法则，删除你认为不需要的法则，而且会不断检索最新的法则并添加进去）：http://jura.wi.mit.edu/siRNAext
siSearch (可以给设计结果评分)：http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.7.html
sFold：http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl
RNAi Codex：http://codex.cshl.edu/scripts/newmain.pl
siRNA User Guide (by Tom Tuschl)：http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html
shRNA Designer：http://shRNAdesigner.med.unc.edu
厂家免费工具：
Ambion公司：
Dharmacon公司siRNA设计：
Dharmacon公司Seed Locator：
Promega公司：
Invitrogen公司：
Genelink公司：

化学合成siRNA

目前化学合成的siRNA主要有：普通siRNA、化学修饰siRNA和荧光标记siRNA。
化学修饰siRNA：可以增强siRNA在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与普通的siRNA相比，延长了作用时间。
荧光标记siRNA：在化学合成siRNA时，可以对siRNA末端用多种荧光标记物进行标记。标记后的siRNA可用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等观察到，确定转染效率，优化转染条件；标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

与siRNA相关的一些技术数据：
1．  siRNA的平均分子量13,300。
2．  siRNA oligo的OD、nmol和质量间有相应的公式可以计算；一般情况下，对于一个21 bp的siRNA oligo，有如下简单关系：1 OD duplex＝3.0 nmols＝40 ug
3．  1 OD的siRNA欲溶解为20 uM的样品，可用150 uL DEPC H2O去重悬1 OD的siRNA，溶解后为20 uM的样品。
4．  荧光标记的RNA，如FAM、HEX、TAMRA等标记的Oligo因为对光敏感，必须避光保存。

siRNA寡聚核苷酸设计原则

    siRNA的设计是决定RNAi实验成败关键性的第一步。并非每个siRNA都能有效引发基因沉默。和引物设计一样，设计有效的siRNA也有一些经过前人经验总结出的规则，而且这些规则随着对siRNA研究的深入也在不断完善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高，3个保证中2个。
    siRNA的反义链3'端最好以UU结尾，这被公认是最有效的的siRNA结构。现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi，你可以尝试。不过如果是体外转录合成siRNA，要避免以G结尾，因为后继处理时RNase会切除末端的G。
    多个siRNA位点最好分散分布在mRNA全长上。没有数据表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特别的关系。如果siRNA位点因为mRNA二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果，分散分布可以减少风险。不过，也有报道说，如果可能，最好能避开起始的50－200个碱基，以避开潜在的调控蛋白结合位点。
    避开和其他基因同源序列，以免“误伤群众”。潜在的目标序列都到这里BLAST一下，www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST，和其他基因有16个以上碱基同源的序列一定枪毙掉。
GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。有较多选择时留意，不要有连续9个以上的GC，也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章，由于siRNA双链上只有一条链会结合RISC上，究竟哪条链取决于RNA解旋酶，而正义链5'端以GC开头，且5'端1－4个碱基GC含量高，且16－19位碱基GC含量低的序列,得到的siRNA反义链5'端GC含量低，3'GC含量高（也有研究表明反义链5'端前7个碱基至少有5个AU），使得反义链比较容易正确结合RISC，因而基因沉默效果比较好。
    如果是shRNA表达载体，用的是RNA聚合酶III类的启动子如U6，最适合的结构是5’GN，后面连续4个U结尾即可令转录终止，要避免序列中G，减出现连续的U/A。
如果是自行设计siRNA的话，一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNAs，平行实验以期提高成功率。据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。

siRNA设计工具

研究人员自建的设计工具，以及一些公开的siRNA信息数据库，仅供参考。
Whitehead Institute开发的工具（可以自定义你认为有用的计算法则，删除你认为不需要的法则，而且会不断检索最新的法则并添加进去）：http://jura.wi.mit.edu/siRNAext
siSearch (可以给设计结果评分)：http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.7.html
sFold：http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl
RNAi Codex：http://codex.cshl.edu/scripts/newmain.pl
siRNA User Guide (by Tom Tuschl)：http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html
shRNA Designer：http://shRNAdesigner.med.unc.edu
厂家免费工具：
Ambion公司：
Dharmacon公司siRNA设计：
Dharmacon公司Seed Locator：
Promega公司：
Invitrogen公司：
Genelink公司：

siRNA转染方法

将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：
—— 磷酸钙共沉淀 ——
将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
—— 电穿孔法 ——
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中
会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
—— DEAE-葡聚糖和polybrene ——

带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
—— 机械法 ——

转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射
使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
—— 阳离子脂质体试剂 ——
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
siRNA转染优化

—— 纯化siRNA ——

为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：
—— 避免RNA酶污染 ——

在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
—— 健康的细胞和严格的操作 ——

微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
通常，健康的细胞转染效率较高；此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。同时严格的操作能够确保转染的重复性，
—— 避免使用抗生素 ——

—— 选择合适的转染试剂 ——
推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。推荐使用生博公司优质的siRNA转染试剂，减少抗生素对转染结果的影响。
针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。推荐使用生博的siRNA转染试剂。

—— 设置合适的阳性对照优化转染和检测条件 ——
对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
—— 通过标记siRNA来优化实验 ——

荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA
胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染
与靶蛋白表达的下调结合起来。

siRNA体内给药问题

    进一步推进RNAi治疗的发展必须建立一个持续的给药系统以将siRNA运输到靶组织。若没有一种有效的且有选择性的方法将siRNA分子运到靶组织并允许细胞内部的运输，这项新型的治疗技术就算再有潜力、再振奋人心，也无法实现它的治疗效果。
    在过去几年内，研究者们发现如果用目前成熟的给药方法进行全身给药，大部分siRNA分子都无法到达其目的地——特定靶组织细胞的细胞质内。许许多多的生物障碍的存在限制了siRNA分子往细胞质的运输，从而限制了siRNA的治疗效果。其中一些障碍包括以下几个方面：
· 由于siRNA分子较小，很快便经由尿道排泄出体外
· 酶作用导致siRNA分子降解/在血清中不稳定
· 运输无组织特异性
· 很难结合到靶组织上
· 需要将siRNA摄入细胞内并招募到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，这个方面也存在不少挑战。
    为了解决这些难题，RNAi领域中的研究者们积极奋斗，开发许多新的给药技术。这些平台包括从局部给药系统、到对siRNA进行化学修饰、到应用合成（纳米颗粒聚合体和脂质体）和非合成（病毒/DNA）载体来进行运输等各项技术。尽管每一项研究都为问题的解决提供了一种有意思的手段，但是没有证据表明某一项技术可以完全解决目前限制siRNA运输的诸多难题。
要想慎重考虑找出最佳的给药系统，首先需要对siRNA运输过程中待解决的诸多障碍的各个特征有一个明确的认识。它们包括：
· 全身摄入方式
· 在运到靶组织之前要保护好siRNA分子并保证其活性
· 让siRNA分子直接结合到靶组织上
· 有效地将siRNA分子释放到靶组织细胞的细胞质中

siRNA体内给药系统

    虽然目前采用局部施药技术较多，但此类给药方式的局限在于只适用于那些目前已有局部治疗方法的病症（比如对呼吸系统用吸入治疗，对眼疾进行眼部注射等等）。
    相反，如果采用全身给药法，又能够做到精确地将药物运到某特定组织的话，那么它就有望被应用于更多的病症。此外，全身给药法更引人注目的因素还在于它更容易推广，而且也更容易为病人所接受。目前开发的大部分siRNA运输方案都是基于全身给药进行设计的。其中包括化学修饰法和合成载体及病毒载体法。
    为了避免siRNA被降解或者被肾脏排泄出去，必须保证从施药