DNA条形码.doc

DNA条形码
条形码技术(Barcode techniques)是为实现对信息的自动扫描而设计的，它在零售业的发展过程中起到了重要作用，节省了交易时间，提高了销售效率。随着分子生物学技术和生物信息学的发展，基于DNA bar．coding技术进行鉴定和分类的研究已成为生物分类学研究中引人注目的新方向和研究热点。关于DNAbarcoding的大量报道见诸于相关学术刊物和其他媒体上，如Science_1I2]，Nature ]，PNAS_5I6]，The NewYork Times¨， National Geographic News 等。生物条形码协会(Consortium for the Barcode of Life)已有40个国家的130多个研究单位参与其中 。生物条形码网站http：／／www、barcodinglife．con，真菌编码网站ht．tp：／／www．allfungi．org／，鳞翅目编码网站http：／／www．lepbarcoding．org／，鱼类编码网站http：／／www．fishbo1．org／等网站相继建立，2007年5月10日，世界上第一个DNA barcoding鉴定中心在加拿大University ofGuelph成立 。本文综述了DNA barcoding技术的研究现状，并就该技术在中药材鉴定中应用的技术方法、技术路线、关键问题以及应用范围等方面开展研究进行了论述，为建立中药材DNA barcoding鉴定技术奠定基础
　　1．DNA条形码的定义
　　在DNA分类学(DNA Taxonomy，即以DNA序列作为生物分类系统平台)的基础上 剐，加拿大动物学家Paul Hebert等对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动
　　物共11门13 320个物种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(Cytochrome C oxidase I，CO I)基因序列比较分 析，除腔肠动物Cnidaria外，98％ 的物种遗传距离差异在种内0％ ～2％ ，种间平均可达到11．3％ ，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种，作为物种的条形编码，为全球生物编码 ’ ，即DNA barcoding(DNA条形码)是利用一段标准DNA 序列作为标记来实现快速、准确和自动化的物种鉴定，类似于超市利用条形码扫描区分成千上万种不同的商品。由于Paul Hebert
　　首先倡导将条形码编码技术应用到生物物种鉴定中，因此他被称为DNA条形编码之父。
　　2．作为DNA条形码序列的特点及与基因组序列
　　理想的DNA barcdoing应当符合下列标准：(1)具有足够的变异性以区分不同的物种，同时具有相对的保守性；(2)必须是一段标准的DNA区来尽可能鉴别不同的分类群；(3)目标DNA区应当包含足够的系统进化信息以定位物种在分类系统(科属等)中的位置；(4)应该是高度保守的引物设计区以便于通用引物的设计；(5)目标DNA区应该足够的短以便于有部分降解的DNA的扩增⋯ 。DNA barcoding作为生物“种水平species—level”鉴定的工具引人注目。Genbank数据库中CO I序列正在快速增加。Min等分析了CO I序列及其来源基因组核苷酸含量之间的关系，结果表明849个CO I基因的5 端的DNA barcoding序列令人惊奇地准确地代表了其来源完整线粒体基因mtDNA的重要信息，也就是说对于未测序的基因组，从DNA barcoding能快速预知完整基因组的组成 。
　　3．DNA条形码的发展及研究进展
　　2003年3月，20多位分类专家、分子生物学家和生物信息学家会聚美国冷泉港，召开了题为“Taxonomyand DNA”的会议。提出对全球所有生物种的某个特定基因进行大规模测序，以期实现物种鉴定的目标，进而推进生物进化历史的研究。9月，在冷泉港再次召开题为“Taxonomy，DNA and the Barcode of Life”的会议，对DNA条形编码所有真核生物的科学性、社会利益有了更深入的讨论和确定，并且还提出了组织策略及国际生物条形编码计划(International Barcode of Life Pro—iect)的发展蓝图 。利用DNA barcoding可以进行物种的鉴定、发现新种和隐存种，如巨藻 、马达加斯加蚂蚁 、蝴蝶 、热带鳞翅类 引、澳大利亚鱼 、显花植物 等。Hebert等对鳞翅目(Lepidopterans)昆虫200个密切相关的种进行CO I基因特定片段分析的结果表明该特定片段可以100％成功地鉴定每一个个体 。Yoo等
　　运用CO I作为条形码对韩国92种鸟类物种进行了有效鉴定。同时，CO I基因特定片段作为DNA barcoding在真菌的鉴定研究中也取得了有价值的结果 。Min等对Aseomyeota、Basidiomyeota、Chytridiomycota的3 1个真菌物种CO I进行了研究，结果显示约600 bp的CO I基因片段长度可以准确进行鉴定 。由于CO I基因在植物中的进化速率远慢于在动物中的进化速率，不适合作为大多数植物的编码基因，许多学者对植物中适合作为DNA barcoding的基因进行了积极的探索。Kress等应用rDNA ITS序列和质体trnH—psbA基因间序列对53个科88个属99个物种的进行研究，结果表明rDNA ITS序列和质体trnH—ps—基因间序列可以对植物物种进行DNA条形编码 。Chase等评价了叶绿体rbcL序列和rDNA ITS序列，并提出在陆地植物长期的DNA条形编码目标研究中，需要进行更为精确的多标记序列条形码研
　　究 。Taberlet等研究认为叶绿体trnLUAA)内含子全序列(254—767 bp)及其P6环(10—143 bp)在作为DNA条形编码中虽有不足，但仍具有许多优势，如引物高度保守，扩增体系稳定，P6环在高度降解的DNA样本中仍然可以扩增出来，在食品行业，法医鉴定和永冻层中的样品的鉴定研究中优势明显⋯ 。
由此可见，DNA．~arcoding技术可以利用一段或几段标准DNA序列实现动物、植物和真菌物种的快速鉴定，该技术将是今后生物物种鉴定发展的必然趋势。

什么是条形码技术
DNA条形码扫描技术
开放分类： 科学、分子生物学、生物分类学、前沿科技

就像超市通过条形码识别商品一样，有一天，你可以手持DNA条形码扫描仪，到森林里去认识每种动植物。

设想在一个闷热的夏日夜晚，突然你的手臂被蚊子叮了一下。你立刻挥起另一只手，把这只蚊子拍死在手臂上。然而，手臂已经肿起了一个小包。你有没有产生这样的后怕：这只蚊子是否携带西尼罗河病毒？

如果科学家保罗·赫伯特的构思能够实现，那么10年内，你就可以轻而易举地解决这种疑问。只需把被你打扁的蚊子身上的一部分放到掌上型扫描仪中，几分钟之内，这个小机器就能显示出有关这个蚊子种类的信息，告诉你刚才有没有接触到西尼罗河病毒。

尖端技术，平凡应用

赫伯特是加拿大圭尔夫大学的动物学家，他被称为DNA条形码技术之父。这一概念认为，就像在商店里扫描仪读取条形码那样，地球上每种植物和动物也都能通过快速地分析DNA中的一小段加以识别。

“这种技术的使用将十分简单，每个人都能识别遇到的任何一种生物。”他说。只要把生物体的一小部分——皮、毛发、叶子等放到DNA条形码扫描仪里，它就能识别出任何一种生物。赫伯特设想了这种装置的许多用途：帮助航空公司识别与飞行器相撞的鸟类；协助生物学家确定被解剖的青蛙最后吃的是什么东西；让卫生监督人员在加工食品中发现不符合规格的动植物成分；让每个人都能随时学习周围的动植物知识。

生命条形码协会的执行秘书戴维·欣德尔指出，DNA条形码还可以加速发现新的物种。目前，分类学者已经识别了大约200多万种的动植物，而据估计，地球上共生存着1000多万种动植物。欣德尔认为，使用DNA条形码技术，科学家能够找出那些在条形码数据库中没有的种类，让分类学家解放出来去关注那些“全新的和激动人心的事物”。

本月，科学家将在伦敦召开生命条形码协会的第一次国际会议。届时，他们将讨论DNA条形码科学的进展，以及为1000万个物种建立条形码库打开国际合作的局面。这个数据库将设置在美国国立卫生研究院，向公众开放的DNA序列数据库GenBank中。

此外，赫伯特和同事已经在圭尔夫大学汇编了一个条形码数据库。双方正在进行讨论以确定这两个数据库是否互补。

什么是DNA条形码

为了让条形码数据库成为一种经济有效的工具，生命条形码协会正集中研究在所有生物当中都存在的一个基因——细胞色素氧化酶1（CO1，cytochrome coxidase 1）的一部分。这部分DNA序列能够区分出物种差异，其方式与超市利用条形码区分不同品牌的同种商品几乎一样。

“对于大部分动物群体而言，利用CO1基因的方法十分有效。因此，如果要使用条形码技术的话，应该从那里开始。”赫伯特说。

CO1基因位于细胞线粒体中，只能从母体中遗传（大部分在细胞核中找到的基因是从母体和父体共同遗传下来的）。赫伯特指出，线粒体DNA积聚突变的速度比核DNA快10倍。因此，关系密切的物种之间，线粒体DNA的差别要大于核DNA的差别，因而也更容易区分不同的物种。

赫伯特说，CO1基因很容易从许多动物中分离出来，有很大一部分的动物生命已显示出有截然不同的CO1序列。然而，CO1对于维管束植物（用导管输送液汁的植物，如蕨类和开花植物等）优势不十分明显。

在本月的会议上，科学家将讨论能快速确定物种的植物基因。

被隐藏的新种群

2004年10月发表的两项研究阐明了DNA条形码的功能。发表在《大众科学图书馆生物卷》（PLoS Biology）的一篇论文当中，由赫伯特带领的研究人员为260种北美鸟类排出了DNA条形码序列。结果发现，每只鸟都有单独的条形码，而种类间的差别，平均比同一种类不同个体之间的差别高出18倍。

在研究过程中，赫伯特和同事还在4个种类当中发现各存在两种不同的CO1条形码的组。这表明，原来认为的1个种类，实际上由2个种类组成。DNA条形码显示出了北美鸟类的4个新品种。

另一项研究中，由宾夕法尼亚大学的生物学家丹尼尔·詹曾带领的研究人员运用DNA条形码证实了1种在哥斯达黎加常见的蝴蝶——Astraptes fulgerator，实际上是10种蝴蝶。这项研究发表在美国科学院院刊上。

当研究人员意识到，捕捉到的2500只野生Astraptes fulgerator幼虫能根据其不同的颜色和对食物的喜好分成几个不同组时，他们想到了存在许多不同种类的可能性。然而，成年的蝴蝶是不能区分的。詹曾指出，“如果给Astraptes fulgerator种群范围界定很广的话，不难想象其中可能包含了许多被隐藏的种群。”

最响亮的批评声

加州大学伯克利分校的脊椎动物学家克雷格·莫里茨和卡拉·西塞罗在《大众科学图书馆生物卷》发表了对赫伯特北美鸟类研究的评论。他们质疑这项技术能否可靠地区分近缘种的差异——这是对DNA条形码的批评中最响亮的声音。

他们指出，DNA条形码技术与其它分类学方法结合使用，能够帮助区别个体以及加快发现新种类的速度，但他们对该技术在何时何地使用持怀疑态度，指出“最大的挑战存在于热带动植物的分类”。

欣德尔说，生命条形码协会欢迎批评。但是，他并不相信条形码的局限性会阻止分类学者在他们的工具箱中使用这种技术：“我认为最重要的问题是：DNA条形码技术会不会在分类学的修正和修饰过程中起作用？我认为答案是十分肯定的。”

“中国药用动物DNA条形码研究”揭秘

时 间：2010-10-14 10:49:02  阅 读： 11 次　  　 责任编辑： 乔俊弘

　　收银员将货物在机器前轻轻一刷，有关这个货物的信息就立刻显示在电脑屏幕上，这样便捷的货物辨识方式依赖于一项技术?D?D条形码。在不远的将来，我国所有的药用动物也将会有一个由该物种的DNA信息组成的条形码，从而有效地提高药材真伪鉴别的水平，甚至进一步推动药材种植、生物制药等的发展。记者从中国中医科学院中药研究所获悉，由该所牵头，国内十几家科研院所参与的“中国药用动物DNA条形码研究”已于日前启动。那么，到底什么是DNA条形码，这一研究又将怎样展开呢?记者就此进行了采访。
　　DNA条形码：鉴别动物药的“利器”
　　在药材市场，面对来源繁多的，甚至已经粉碎的动物药材，许多人都会有这样的想法：这是什么?这是真品么?这些疑问其实也正是长期困扰我国中药界的一个难题---由于大部分动物药都是贵重、紧缺药材，通常以粉末等形式入药，因此市场极为混乱，鉴别十分困难。
　　“在不远的将来，通过DNA条形码研究，这个问题也许会被轻而易举地解决。”中国中医科学院中药研究所的李军德副研究员说，你只要将待鉴别的动物药材的一小块放进专门的快速检测仪器中，这个药材的DNA信息就会显示出来，再把这个信息与数据库中该物种的标准DNA序列进行对比，就可以鉴定它的真伪。
　　李军德告诉记者，动物药真伪鉴别问题实际上涉及一个非常专业的领域---分类学。以往的分类学研究方法主要侧重于形态学比较，最近30年，分子系统学发展迅速，产生了分子分类学和DNA分类学等概念。2003年，加拿大学者Hebert等将分子方法拓展到整个生物分类应用当中，首次正式提出了DNA条形码的概念。
　　所谓DNA条形码，是指利用一段标准DNA序列作为标记来实现快速、准确和自动化的物种鉴定。这种新兴分类学技术引起了越来越多的生物学家的关注，成为物种鉴定和分类学研究的新方向和研究热点。目前，作为“国际生命条形码计划”四个中心节点(加拿大、美国、欧盟和中国)之一，我国在世界生物DNA系统分类及条形码技术中占据相当重要的地位，植物，包括药用植物的DNA条形码研究已经全面启动。
　　“将DNA条形码技术应用到药用动物领域，就好比给每个药用动物制定了特有的‘身份证’，将有效地解决动物药鉴别的难题。”李军德说。
　　当前研究局限：实际应用不够
那么，我国现有的技术能力是否足以开展药用动物DNA条形码研究呢?中国中医科学院中药研究所的唐仕欢博士介绍，目前国际上的DNA条形码研究技术已经比较成熟，主要针对在所有生物当中都存在的一个基因---细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因的一部分进行分析。这部分DNA序列能够区分出物种差异，就像物种的“身份证”编号。
唐仕欢指出，近年来，我国在中药材DNA分子鉴定技术上取得快速进展，涌现出RFLP、RAPD、AP-PCR以及基因芯片等技术，已经具备开展药用动物DNA条形码研究的能力。但总的来说，我国的药用动物DNA分子鉴定研究还存在不少问题。
　　首先是研究品种十分局限，主要集中在蛇类中药材、鹿类中药材，以及鸡内金、海马、龟甲等少数品种。而对其他常用的品种，如虻虫、斑蝥、蝉蜕、土鳖虫、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣等，则研究不多。
　　其次是参与单位较少。从事动物药材分子鉴定的研究机构主要有中国药科大学、沈阳药科大学、南京师范大学、北华大学、中国科学院昆明动物所、安徽大学、北京中医药大学、中国中医科学院中药研究所等少数大中专院校和科研院所。加之从事动物药材鉴定和分类学研究的队伍不断缩减，使得全面而系统地开展动物药材分子鉴定研究面临巨大挑战。
　　第三，数据共享不足。由于各自研究比较分散，品种局限，在分子鉴定的操作中，没有形成统一和规范的操作标准和规程，如药用动物遗传物质材料采集规范、动物药材DNA提取操作规范等，难以形成共享的分子鉴定数据信息系统，从而限制了相应技术和方法的推广应用。
　　第四，实际应用不够。有关动物药材的分子鉴定重点在基础研究，虽然在很多相关报道中，均提示建立的方法具有简单、准确、快速、灵敏度高、重现性好等特点，但在实际操作中得到推广应用的很少。
　　新研究展望：打造动物药材的“身份证”
　　此次中国中医科学院中药研究所牵头的“中国药用动物DNA条形码研究”，将与长春中医药大学、广西药用植物研究所、重庆中药研究院及云南中医学院等多家单位展开联合攻关。近年来，中国中医科学院中药研究所先后开展了乌梢蛇、蕲蛇、金钱白花蛇等蛇类药材高特异性PCR鉴别研究，其中乌梢蛇、蕲蛇的研究成果被作为国家鉴别蛇类药材标准收录到2010版《中国药典》。同时，他们还开展了32味常用动物药材的DNA条形码研究。
　　据了解，“中国药用动物DNA条形码研究”将以《中国药用动物志》修订为基础，测定13门34纲148目416科2080种(亚种)药用动物的DNA条形码。目前，相关研究机构已制定了药用动物遗传物质材料采集规范、动物药材DNA提取操作规范等，下一步将联合国内各有关科研院所、大中专院校按照标准的操作规范，进一步扩大样品数量，完善标本的采集，利用分子生物学技术获得动物药材标准序列，构建动物药材DNA条形码分子鉴定的标准平台。
　　在此基础上，该研究组还将联合全国有关科研院校，制定、完善药用动物种质资源的描述标准、技术规程;逐步建立“中国动物药材分子鉴定数据库系统”，包括“中国动物药材DNA条形码数据库”、“中国动物药材分子标识数据库”、“中国动物药材分子鉴定基因序列数据库”等，实现信息数据共享。这不仅将为动物药材的鉴定提供依据，而且为药用动物的分类及其遗传多样性研究奠定基础。(徐亚静)

查文献 植物条形码研究进展（二）
生物多样性，2008,5:417-424
宁淑萍、颜海飞、郝刚

植物DNA条形码技术

      中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室，北京100093摘要DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，从而实现对物种的快速自动鉴定。尽管这一技术在理论上和具体应用上仍存在很多争论，但DNA条形码概念自2003年由加拿大分类学家Paul Hebert首次提出后就在世界范围内受到了广泛关注。在植物类群中条形码的研究和应用尚处于探索阶段，稍落后于对动物类群的研究，这丰要表现存：(1)DNA条形码的选择及其评价仍没有统一的标准：(2)对类群较全面的形态分类学修订和植物DNA条形码研究的结合十分缺乏：(3)以往研究在取样上尺度较大，而对具体类群的研究较少，一个科或一个属只用有限的种类作为代表，同一种内的取样个体数量也不足，这样虽然表而上看来利用选定的DNA条形码可以较容易地把代表物种区分开，但实际上目前建议的植物DNA条形码(例如由生命条形码咨询委员会植物工作组最近提出的rbcL和matK)由于其分子进化速率较慢，在种级水平上，特别是对于那些经历了适应辐射或快速进化的属来说，分辨率较低。而DNA条彤码的应用主要集中在属内物种水平的鉴别，因此只有针对具体类群进行探索研究，发现进化速率较快、分辨率高且通用性好的条形码，才可能为建立完整的条形码数据库起到积极有效的作用。关键词  ITS，matK，形态分类学，植物DNA条彤码，rbcL，trnH-psbA
    分类学的主要任务包括描述和鉴定物种，提供简洁、方便的信息检索系统(Davis and Heywood，1963)。自双名法确立以来的250多年里，人类共鉴定和捕述了约170万种生物(Hawksworth，1995)，但这仅仅占到分类学家预计物种数量的15％(Gregory，2005)。以往的分类学研究方法土要侧重于比较形态学方面，研究较为深入的大类群仅包括脊椎动物、昆虫及高等植物，而对微小生物(休长不足1—10 mm的类群，如细菌、线虫和螨虫等)的研究较少。因此，对地球上如此众多的物种进行分类和鉴定仍然是一项长期而艰巨的任务(Blaxter，2003：Tautz et aI．，20031。
    最近30年，分子系统学发展迅速．利用DNA数据探讨植物的系统发育已经成为研究者普遍接受和采用的于段。其间，虽然也有不少学者试图将分子生物学和生物信息学技术应用到分类学领域，并产牛了分子分类学和DNA分类学(DNA taxonomy)等概念(Tautz et aI．。2002。2003)。然而直到几年前，Hebert等(2003)将分了方法拓展到整个生物分类应用当中，才首次正式提出了DNA条形码的概念。一些学者认为DNA条形码未来会将传统分类学取而代之(Wheeler，2004：Ebach and Holdrege，2005)，但多数学者认为它将会弥补传统分类学方法的不足(Godfray，2002：MaIlet and W…mott，2003：Hebert and Gregory，2005：SchindeI and M…er，2005)，是对日渐萎缩的传统形态分类学强有力的补充，其文质是作为种新的性状来构建分类系统，实现序列本身变异信息与现有形态分类学的结合(DeSalle et a1．，2005：Kristian— sen et a1．，2005：W…et aI．，2005：Haase et a1．，2007；H ajibabaei et al，2007；VogIer and Mona— ghan，2007)，加快对全球生物物种进行分类和鉴定的步伐(Smith et a1．，2005)甘能够在分类学修订、新种和隐存种的发现以及资源利用等生物多样性研究方而提供新的思路和研究工具(Dayrat，2005：Fltzhugh，2006：Agnarsson and Kuntner，2007)，同时将分类学结果应用于生态学调查、濒危物种监测和保护、中草药资源鉴定、法医鉴定、药物和食品市场监督等诸多领域(Newmaster et aI．，2006；Taberlet et aI．．2007；陈士林等，2007；Valentini et aI．，2009；Chen et aI．，2010)。1  DNA条形码的概念DNA条形编码(肖金花等，2004)或称DNA条形码技术(DNA barcoding)足利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定(Hebert et aI．，2003)。自DNA barcoding的概念提出以来，围绕着条形码的开发和应用，首先提出了DNA条形码的选择标准：(1)尽量短的片段，两端连接相对保守的区域，利用通用引物容易扩增：(2)要有足够的变异可将物种区分开来。在此标准下，编码细胞色素C氧化酶l的线粒体基因COl(或coxl)以较大的优势首先被动物学家选用作DNA条形码，并在一些昆虫、鱼类和鸟类的研究中得到了较好的结果(Hebert et aI．，2004b；Smith et a1．，2005；H ajibabaei et aI．．2006；Yoo et aI．，2006)。其次，一部分学者认为对分类群开展全面细致的形态分类学研究是正确取样的前提(Meyer and Paulay，2005；DeSalIe，2006)，涵盖物种的整个分布区，并在居群水平上准确和较密集取样可以弥补数据分析方法上的不足。最后．在条形码数据库的展现形式和验证手段方面主要提出了以下方法：(1)基于遗传分化距离的建树泫，其依据足种内差异最大值小于种间差异最小值(Matz and Nielsen。2005；Nielsen and Matz，2006)：(2) Blast分析的相似法(Meier et a1．，2006)，其难点在阈值的选择和不同类群异质化进化速率上：(3)基于DNA序列本身特征的方法，如DNA bar等(DasGupta et aI．．2005；DeSalle et a1．，2005；Kelly et a1．，2007；Little and Stevenson，2007；Lou and Golding，2007；Rach et a1．，2008)。2国内外研究现状利用DNA条形码技术有望实现对物种的快速自动鉴定，从而克服传统分类学研究方法的诸多缺陷，例如：(1)对各种形态特征齐全的标本的依赖，对于被子植物来说，根据缺少花果的标木，是很难止确鉴定到种的：(2)对分类学专家的依赖，分类学专家往往需要经过多年的培养才能擅长于某一门类，而当前人类对生物资源利用的范围和强度均日益加大，相比之下传统分类学专家队伍却急剧缩减。囚此，DNA条形码概念在2003年一经提出，就得到了科技界和社会的积极响应。2004年，Sloan基金会在华盛顿Smithsonian国家自然历史博物馆成立了生命条形码联盟(consortium for the barcode 0f I．fe，CBOL)，致力于发展鉴定生物物种的全球标准。2005年2月，由CBOL和英国自然历史博物馆主办的生命条形码协会第一次围际会议在伦敦召开，讨论决定为1 000万物种建立条形编码库。2007年9月在台北召开的第二次及2009年11月在墨西哥召开的第三次国际DNA条形码会议上，都对理想条形码的选择给予了高度重视，对在全球推进DNA条形码研究计划起到了重要作用。
    事实上，早在Paul Hebe~提山DNA条形码概念之前，人们已经开始利用DNA片段研究细菌和古细菌的分类与系统发育。目前在动物中，利用线粒体基冈片段COl为标记，在一些类群中已部分实现了条形码鉴定，如蝴蝶(Hebert et a1．，2004a；H ajibabaei et
 aI．，2006；Elias et a1．，2007)、鸟类(Hebert et a1．，2004b；Yoo et a1．．2006；Kerr et aI．，2007；Tavares and Baker，2008)和鱼类(Ward et aI．，2005；Savolainen et aI．，2005)。COl在真菌和藻类中的分辨率较高，亦可使用，但对于陆地植物因其线粒体基因的进化速率相对较慢，而不适合。因此，在对植物的研究中，不少学者尝试从叶绿体基因组和核基因组中寻找理想的DNA条形码(Cho et a1．，2004；Chase et aI．，2005)。
    Kress等(2005)利用9个叶绿体基因间隔区(trnK-rpsl6、trnH-psbA、rpl36-rps8、afpB-rbcL、ycf6-psbM、trnv-afDE、trnC-ycf6、psbM-trnD和trnL-F)和植物系统发育重建研究中常用的rbcL，以及核糖体DNA片段ITS，对整个被子植物类群进行了取样和研究，认为单独使用rbcL，会囚为变异程度低而难以满足要求，提出ITS和trnH-psbA是较好的选择．建议通过采用多基因片段的组合来实现刘植物类群的条形码鉴定。Newmaster等(2006)在对陆生植物进行广泛取样研究的基础上，肯定了rbcL在较高分类阶元(科属及以上水平)上的应用潜力，并提出多基因阶层条形码概念。Presting(2006)对叶绿体基因组保守变异区域进行了全面详细的分析，为从叫绿体基因组中选择理想的DNA条形码提供了很有价值的参考数据和建议：(1)UPA(universal plastid amplicon，the portion 0f 23S rDNA)非常适合于藻类的研究，但同时也可作为陆地植物的组合条形码之一：(2)trnD— tmY比先前提出的trnH-psbA的分辨率更高，但可惜的足，由于trnD-trnY目前在基因数据库中的记录还不多，尚未像trnH-psbA那样引起足够的重视。Kress和Erickson(2007)对陆地植物中大尺度取样后，明确提出可以利用rbcL和trnH-psbA组合作为整个陆地植物的条形码。之后，Chase等(2007)又提出了使用2个条形码组合(即rpoCl、rpoB和matK；rpoCl、matK和trnH-psbA)的建议，并强调了matK在高等植物研究巾的重要性。Lahaye等(2008a)在主要对兰科植物进行大规模取样的研究中使用J，8个叶绿体DNA片段，最后通过比较也建议matK作为有花植物通用的条形码。在台北举行的第二次DNA条形码国际学术会议上，afpF-afpH得到了与会者的重视，被建议作为备选条形码之一。Lahaye等(2008b)对韩国植物学家Kim Ki-Joong等提出的afpF-af plL，和psbK-psbl进行了验证．同时结合mafK和trnH-psbA对南非一个公园中的101个物种进行J，研究，结果显示：trnH-psbA和afpF-atpH序列中的gap编码能有效地提高物种鉴别率，但仍然支持把matK作为植物DNA条形码组合中必不可少的要素。在最近发表在PNAS上的一篇论文中，CBOL植物工作组根据以往研究和该工作组所提供新数据的分析结果正式建议将rbcL和matK作为陆地植物通用的条形码(Hollingsworth et aI．，2009)。
    以上研究在较大类群范围内，如整个被子植物，甚至整个陆地植物，发现并测试了目前比较常用且最有可能作为DNA条形码的分子标记。其共同点是：在属内物种水平上取样不足，得到表面上拥有较高分辨率的结果，离创建全面可信的条形码数据库仍有‘定的距离。因此，一些学者用一个或几个候选分子标记在较小范围内，如在1个属或1个科内通过较密集取样在种级水平上测试其分辨能力和适用性。Sass等(2007)利用7个叶绿体基因和核糖体ITS片段，对裸子植物苏铁类群进行了探索研究，并提出ITS在变异程度上是最适用的。Newmaster等(2008)对7个叶绿体DNA片段fUPA、rpoB、rpoCl、accD、rbcL、matK和trnH-psbA)进行了DNA条形码最适性检测，选择matK和trnH-psbA组合对肉豆蔻科的毛楠属(Com— psoneura)进行研究，获得了较好的结果。Logacheva等(2008)存对伞形科独活属(Heracleum)植物进行的系统学研究中指出trnH-psbA不适合用作该类群的DNA分子标记。对于物种多样性丰富的热带地区，Steele等(2010)用5个叶绿体DNA片段组合，对葫芦科Psiguria属的6个种进行了条形码鉴定，发现每个物种均拥有各自独特的条形码。2009年11月7同至13曰在墨西哥召开的第三届DNA条形码国际学术大会上，与会者达成共识，一敛建议在rbcL和matK之外，选择进化速率较快的ITS和trnH-psbA，探讨它们在陆地植物中的通用性、分辨率和适合程度。
    我同学者在Paul Hebert提出DNA条形码的概念之后不久就开始关注这项技术。肖金花等(2004)、马兰和黄原(2005)、陈士林等(2007)、王剑峰和乔格侠(2007)、陈念等(2008)、莫帮辉等(2008)和宁淑萍等(2008)分别以综述形式对DNA条形码技术进行了介绍。吲时，利用线粒体基因COI对一些动物类群开展了研究(董世娟等，2005；褚栋等，2005；林元烧等，2005；梁刚等，2008)。在植物方面，葛学军研究组存科级水平上利用10种分子标记(afpF-afpH、matK、psbK-psbl，rbcL、rpoB、rpoCl、trnH-psbA、rps4、trnL-tmF和TS2)对藓类植物进行了评价，发现rbcL、rpoCl、trnH-psbA、rps4和trnL-tmF可以作为候选的DNA条形码(Liu et a1．，2010)。周世良研究组将DNA条形码技术用于澄清芍药科芍药属牡丹组的物种问题(张金梅等，2008；Zhang et aI．，2009)，他们在居群水平上对37个个体取样，利用来自叶绿体基因组的4个DNA片段(ndhF、rpsl6-trnQ、trnL-F和trnS-G)分析了该分类群的系统发育关系，探讨了组内进化谱系和分类学上所命名的物种之问的关系，还以牡丹组为例，讨论J，DNA条形码技术在应用过程中所遇到的问题和解决方案，提出在利用条彤码进行物种鉴定时，应首先对分类群进行系统发育分析，了解谱系进化线和物种的关系。陈世林研究组在药用生物中筛选DNA条形码，对753属4 800种藻类、真菌和高等植物的6 600条ITS2序列进行了分析，发现lTS2在种级水平上的分辨成功率可以达到92_7％，建议ITS2可作为真菌和绿色植物的一种新的DNA条形码(Gao and Chen，2009；Chen et aI．，201 0)。在本文作者研究组丌展的一项工作中(Ren et a1．，2010)，我们利用4个DNA片段(ITS、rbcL、matK和trnH-psbA)对桦木科桤木属(AInus)全世界所有的物种(26种)的131个个体进行取样分析，发现4个片段在种级水平上的分辨能力分别为10％(rbcL)、31．25％(matE)、63．6％(trnH— psbA)和76．9％(ITS)，而将ITS和trnH-psbA结合在一起使用可以分辨全部种类巾的88．5％。同时以桤木属为例．讨论了分类学修订对于正确运用DNA条彤码技术进行物种鉴定的必要性。以及曲者之间所存在的互动关系。3存在的问题和展望3．1  目前DNA条形码技术的局限性就整体而言，在植物类群L卜l条形码的研究和应用尚处于探索阶段，稍落后丁对动物类群的研究。这主要表现在以下几个方面。(1)植物DNA条形码的选择及其评价仍没有统一的标准。在生命条形码概念提出之初，生物学家希望能找到一个基因或者一小段DNA序列就可以区别地球上所有的物种。即Jone gene for alI species。但根据目前的研究，即使对于动物来说。仅仅运用COl这一段线粒体DNA序列来实现对所有物种的鉴定仍然存住很大的不足和困难。对于高等植物来说，在提出将rbcL和matK作为组合条形码之后，也仍然不能实现对物种的全面鉴定。此外，随着生物多样性保护、约品和食品市场规范以及资源调查等方面的社会需求日益增长。在选择DNA条彤码时还要考虑各种具体需求的特殊性。(2)对类群进行形态分类学修订是开展棺物DNA条形码研究的基础，而植物DNA条形码反过来可以检验形态分类，但目前传统形态分类学和现代分子分类学还未能达到有机的结合。DNA barcoding必须依赖传统的形态分类学，在条形码数据库建立之前，取样必须建立在形态分类学研究的基础上：建库后，验证要以形态分类学结果作为参照标准。(3)以往的研究在取样上尺度较人，而对具体类群的研究较少，1个科或1个属只用有限的种类作为代表，同一种内的取样也不足，这样虽然表面上看来利用选定的DNA条形码可以容易地把代表物种区分开，但实际上日前建议的植物DNA条形码(例如rbcL和matE)由于其分子进化速率较慢，在种级水平上，特别是对于那些经历了近期适应辐射或快速进化的属来说，分辨率较低。而DNA条彤码的应用主要集中在属内物种水平，因此只有针对具体类群进行探索研究。才可能为建立完整的条形码数据库起到积极有效的作用。
    因此充分利用基因组信息，在植物、动物和微生物中筛选其它候选基因，仍然是今后一段时间内DNA条形码研究的主要任务。通过对多个类群和多个基因的比较，评价分类群种内和种问差异的人小。提出物种鉴别的分子变异尺度，对不同marker的使用范围进行评价。尽管在动物DNA条形码的研究中，COl以较大的优势成为动物条形码首选，并在‘些昆虫、鱼类和鸟类的研究中得到了较好的结果(Hebert et a1．，2004b；Hajibabaei et aI．，2006)，但也有研究表明单个线粒体基因片段在热带物种多样性高的区域中应用有一定的局限性(Rubinoff et a1．，2006a)。另外，在鉴定存在杂交的类群时，作为单亲遗传