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小鼠nanos2Nanos2基因的研究进展
摘要：Nanos是最先被鉴定的一个母源效应基因，后来在其他生物中都发现有其同源物存在，主要作用是促进性腺的发育。不同物种或同一物种不同的nanos同源物的功能和作用机制都不尽相同。在小鼠中nanos有三个同源物nanos1，2，3.Nanos1在性腺和脑组织中都有表达，nanos2和Nanos3具有生殖特异性，只在性腺中表达，尤其是nanos2，在生殖细胞发育过程中不可或缺。Nanos2不仅维持PGC和SSC的自我更新，而且是一种启动雄性分化程序的内源性因子，在胚胎发育时期只表达于雄性生殖细胞中。了解nanos2的功能和作用机理有助于让我们对胚胎发育过程和性别决定调控有更清楚的认识。

关键词：nanos2 精源干细胞 性别决定 自我更新

Nanos基因最早由 在果蝇中发现，它编码一种RNA结合蛋白，这种蛋白与pumilioRNA结合蛋白相互作用形成一种核糖核蛋白复合物一起抑制母源mRNA hunchback的翻译，从而调控果蝇胚胎后腹部细胞的分化。进一步研究发现进一步研究表明nanos对果蝇生殖细胞的发育是必须的，Nanos基因的缺失将使果蝇不能形成性腺，产生异常生殖细胞。随后，科学家在线虫，、蜜蜂，、家蚕等物种中也相继发现nanos同源物，它们的功能也都和个体发育或生殖细胞的发育分化有关。小鼠中含有三个nanos的同源物，分别命名为Nanos1，2，3.。其中
小鼠中，Nanos1在小鼠胚胎，、成体睾丸，成体和脑组织中都有表达。Nanos1基因敲除的小鼠并没有发现性腺的异常，说明Nanos1对小鼠性腺的发育不是必须的或其功能是其功能可以被其他基因代替。Nanos2和nanos3都是生殖细胞特异性的，其基因敲除的小鼠都不能形成正常的性腺，成体中nanos2Nanos2或Nanos3的缺失将导致生殖细胞的丢失。Nanos3在胚胎期两性中都有表达而nanos2Nanos2只在雄性中表达，所以因此，nanos2Nanos2是一个严格的雄性生殖特异性基因。现本文就对nanos2Nanos2的结构， 功能以及分子机制等方面做一番综简述。
一Nanos2的结构
Nanos基因在不同物种中差异较大，介于几十到上千bp不等。Nanos2基因全长1439，只含有一个外显子，无内含子，编码区长为410 bp，在靠近C端的序列编码了两个特异锌指结构域CCHC（Cys-Cys-His-Cys），这两个特异锌指结构域在目前发现的所有物种的nanosNanos基因中都是高度保守的。同时敲除这两个锌指结构域将使nanosNanos基因功能丧失。
Nanos2的非编码区3＇UTR部分长为900 bp,, Yaga等（ ）通过基因敲除比较含有和不含nanos2 3＇UTR部分的小鼠，发现不含3＇UTR部分的小鼠曲细精管中生殖细胞的数量明显少于含有3＇UTR部分的小鼠，这表明在没有3＇UTR部分的情况下肯定有一部分生殖细胞丢失了部分的情况下肯定有一部分生殖细胞凋亡了，。我们可以据此可以推断nanos2Nanos2表达水平对正常精子的发生是必须的，而nanos2Nanos2的3＇UTR部分对这个过程起着调控作用。另外，在基因敲除的小鼠中导入含有报告基因Lacz和nanos2含有3＇UTR部分的载体，检测到Lacz在两性细胞中都有表达，但nanos2Nanos2只在雄性细胞中表达，暗示3＇UTR部分在雄性中上调nanos2Nanos2的表达水平，在雌性中下调nanos2的表达水平，推测3＇UTR部分可能存在不同的增强子结合区。前面说到的那部分丢失的细胞可能是因为nanos2Nanos2表达缺失导致的细胞凋亡，也可能是nanos2表达水平下调导致的生殖母细胞的分化大于增殖，后续的实验表明了后者的正确性。
二 nanos2Nanos2的功能
2.1 nanos2在胚胎时期通过启动雄性发育程序。
在胚胎发育早期原始生殖细胞PGC并非产生在真正的性腺位置产生，所以PGC在形成后会在微环境的影响下穿过体细胞进入生殖嵴，即将来发育成性腺的地方。在PGC迁移的过程中这些生殖细胞的性别还没有被确定，它们具有向两性分化的潜能。大多数人认为生殖细胞周围的体细胞对生殖细胞起着性别决定的作用，而nanos2是一个被发现的起性别决定作用的生殖细胞内源性基因的因子。
PGC生殖细胞定植置于生殖嵴后开始性别分化，大约在E10.5天，此后，雌性生殖细胞进入减数分裂并停留在减数分裂一期雌性生殖细胞进入减数分裂并停留在减数分裂前Ⅰ期，而雄性生殖细胞开始增殖或停留在G1／G0期并伴随基因甲基化和印迹基因表达等。Nanos2在13.5天开始表达，15.5天达到高峰之后迅速下降到消失天达到高峰之后迅速下降直至消失。敲除nanos2基因的小鼠不能产生完整的性腺，生殖细胞不断丢失，说明nanos2对生殖细胞的发育是必须的。
通过基因芯片技术检测，nanos2基因敲除的生殖细胞中许多和减数分裂有关的基因转录水平上调，而雄性特异性基因转录水平下调。暗示nanos2可能是通过抑制雌性化而启动雄性分化程序。另一个实验，如果将nanos2在胚胎阶段一直超表达在胚胎期一直超表达，结果超表达的雌鼠在E13.5天生殖细胞的减数分裂被抑制，并且趋向雄性化发育，例如雄性生殖细胞特异性基因Dnmt3l,、TdrdI等表达水平上调。，此这个实验进一步证明了研究进一步证明了nanos2可能通过抑制雌性化而促进雄性生殖细胞发育。上述结论。
2.2 nanos2在小鼠出生后维持出生后小鼠精原干细胞的数量和的自我更新。
在小鼠出生后，nanos2又开始表达，但仅存在于一小部分生殖细胞中。由于传统的基因敲除会使小鼠在胚胎期由于缺少nanos2使生殖细胞凋亡，所以为研究nanos2在小鼠出生后的功能Saga等人采用条件性敲除的方法，使nanos2的缺失时始于出生后。研究发现，nanos2基因缺失后，新生鼠的生殖细胞数量会随年龄的增长而不断减少。这可能是细胞凋亡的结果，也可能是生殖细胞的来源精原干细胞数量的不断减少。可是，检测多聚二磷酸核糖聚合酶的相对含量，发现在对照组和nanos2缺失实验组睾丸中并没有明显的不同，提示我们生殖细胞在Nanos2缺失的情况下不断减少不是生殖细胞加速凋亡的结果。那么也就是第二种可能，也就是说nanos2对精原干细胞的自我更新维持是必须的，没有了nanos2，精原干细胞都走向了分化，生殖细胞没有了持续的细胞来源而导致生殖细胞数量不断减少。为了验证这个结论，研究人员将CAG-floxed-CAT-3×Flag-Nanos2转基因小鼠与Nanos3-Cre 小鼠杂交，得到从胚胎早期就开始表达nanos2的子代雄性小鼠。这种Nanos2超表达小鼠是不育的，睾丸重量轻，曲细精管多数细胞都在基底膜上，也就是精原干细胞所在位置。对特异基因进行分析，减数分裂晚期的基因Scp3表达量减少，C-kit也减少，未分化精原细胞标记基因Plzf表达增强。这些生殖细胞的增殖能力低，凋亡水平正常。这些结果表明nanos2超表达使精原细胞积累，抑制分化而不是抑制生殖细胞凋亡。
三 nanos2分子机制
在果蝇中Nanos蛋白与RNA结合蛋白pumilio形成一种核糖核蛋白复合物一起抑制母源mRNA hunback 的翻译，从而启动胚胎后腹部细胞的特异性分化过程。
在人中同样发现nanos蛋白与pumilio的同源物Pumilio2的相互作用。
但在小鼠中并没有发现nanos2与Pumilio同源物的结合现象。说明Nanos2有另外的分子机制，Nanos基因在不同物种中作用机制不尽相同。
3.1 nanos2定位
应用免疫共沉淀和Western手段，分析到nanos2在E13.5天开始表达，并在表达水平增强的过程中形成聚点，果蝇中Vasa和Tudor会形成细胞质聚点，但经检测这些在小鼠中的同源物并非和nanos2聚点在一起。用双重免疫沉淀反应发现nanos2聚点与P小体复合物组分DCP2和XRN1结合。在E13.5天P小体只存在于生殖细胞中，不存在于成体细胞中，之后在雌性生殖细胞中逐渐减小，E14.5天消失，在雄性生殖细胞中则逐渐增大伴随nanos2的表达。这表明Nanos2即定位于P小体。P小体是一个RNA降解中心，含有多种RNA降解酶，其中DCP2是一种RNA去头酶，XRN1是一种核酸外切酶。所以nanos2很可能与RNA降解有关。
3.2 nanos2相互作用的蛋白复合物CCR4-NOT
免疫共沉淀进一步去研究nanos2相互作用蛋白，陆续发现CNT1，CNT3等一些属于CCR4-NOT脱腺苷复合物元件蛋白都与nanos2相结合。而且在体外CCR4-NOT脱腺苷复合物与nanos2蛋白的结合物具有脱去RNA的polyA的活性。
虽然与nanos2相结合去识别结合目的RNA的蛋白没有找到，但我们可以推测出一种模式，就是nanos2与某个蛋白相结合去识别目的RNA，然后这个蛋白RNA复合物在与CCR4-NOT脱腺苷复合物结合托运到P小体并在此过程中将目的RNA的polyA尾裂解掉，托运到P小体后，目的RNA被进一步降解。
3.3 nanos2结合的目的RNA
对nanos2的免疫沉淀物纯化后进行RT-PCR，结果显示，Sycp3，Stra8，Dazl等只有在减数分裂中高水平表达的RNA在nanos2蛋白沉淀物种被特异性的检测到了，而G3pdh，Dumt3l和Dnmt3a等在雄性生殖细胞中高度表达的mRNA在nanos2的沉淀物中并没有特异性的。这可能是因为nanos2的目的RNA和减数分裂有关。Nanos2蛋白复合物通过托运降解与减数分裂有关的目的RNA而抑制生殖细胞雌性化，启动雄性分化程序。
四讨论四 小 结
Nanos2是生殖细胞发育过程中的一个关键因子，它不仅在胚胎期PGC定植后通过抑制雌性分化程序，而且在出生后性腺中仅存在于精原干细胞中，维持着精原干细胞的自我更新。但关于nanos2的很多问题我们并不清楚，nanos2结合的目的RNA还没有找到，与nanos2相结合参与目的RNA瞄定的另一种蛋白质也没找到。在nanos2结合的蛋白质RNA复合物中除了CCR4-NOT脱腺苷复合物还有没有别的复合物或蛋白？nanos2定位于P小体，P小体不仅是一个RNA降解中心还是一个RNA存储中心，nanos2参与RNA降解，那它有没有参与RNA托运储存的功能呢?等等，这些问题需要我们进一步探索。

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