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实验五 PCR引物设计及评价

【实验目的】
1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。
2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。

【实验原理】
一、引物设计原则
1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；
2、引物的长度一般为15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；
3、引物不应形成二级结构。引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；
4、引物序列的GC含量一般为40-60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大；
5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；
6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7、引物3’端不可修饰。引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。
8、引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加；
9、G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端 G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间 G值相对较高的引物。引物的3’端的 G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应；
【实验方法】

一、引物搜索
1、打开Primer premier5.0软件，调入人瘦素 (leptin) 基因序列：点击“file” “open” “ DNA sequence”；或者直接点击 “file” “new” “DNA sequence”，弹出一对话框如下图，然后将序列人瘦素 (leptin) 基因复制在空白框。
(所用序列）

选取CDS及附近序列，但若CDS比较靠前，应选择比较靠后的序列以保证准确性
2、 序列文件显示如图，点击“Primer”；进一步点击“search” 按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整

然后点击“OK” ，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时，再点击“OK”。

3、这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。

理想情况下最好是没有一个“found”，但是实际情况中一般找不到这样的。最重要的是引物之间特别引物末尾不能有配对（Cross Dimer)，或配对不能超过三个。

二、引物分析
1、打开oligo的页面，将原来的序列在桌面上新建一个记事本文件，然后点击File里的open打开序列

3、在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，但一般主要看Tm值，一般Tm值在55-65度最好。可检验用Prime设计出的引物是否合适。如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮 ，选好上游引物，此时该按钮变成红色，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。

被选中的区域即为所检验的引物，通过看其Tm值发现这个引物还是合适的。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。可以用“Analyse”菜单分析你的引物：比如有无引物二聚体、发卡结构等等。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。

图为引物的一些信息。
【作业】
1、提交使用Primer premier5.0及oligo6.0软件进行人瘦素 (leptin) mRNA引物的设计结果；
（1）使用引物设计软件Primer premier5.0进行人瘦素 (leptin) mRNA引物搜索结果截图。（包括S链和A链截图）
（2）oligo6.0分析此对引物的结果。（包括Duplex formation、Hairpin formation、False Priming Sites截图）
（3）综合Primer premier5.0与oligo6的引物设计结果为：
(1)
S链

A链

（2） 发夹结构形成情况

引物二聚体形成情况

引物错误引发位点

（3）最终引物结果
sense： 5’-CATGAATTCGTGTCGTGCCTTGGAGTT -3’ (27bp)
酶切位点：EcoRI 加粗部分为保护碱基
antisense： 5’- GCTGTTAACCCCTGGAGACCTTGGAGA -3’ (28bp)
酶切位点：HpaI 加粗部分为保护碱基

【实验感想】
1、 Prime5.0的用来设计引物效果比较好，但它计算Tm值的方法有待提高，所以一般在Oligo6中验证一下引物设计的结果。
2、 Prime5.0可以下载破解版，然后随意输入一个激活码即可使用。
3、 设计引物时要综合多方面的考虑，不能单独看一个指标，也不能单独看软件的评分。