外泌体未来的医学研究和应用新方向.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Exosomes,：,Our future target,！,简介,外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中,细胞积极分泌的囊泡样小体,大小较为均一，直径为40100纳米,密度1.101.18g/ml,细胞外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程,并有也许成为药物的天然载体，应用于临床治疗。,Thry C是建立外泌体提取分离鉴定金原则的泰斗(Thry et al,)。,在Cell刊登了一篇综述，文中着重讨论了EV对癌症转移作用的最新发现，下面就是她的综述内容,Exosomes,还是,EV?,Thry C提出应当是 exosomes“而不是”exosome”(Thry,et al.),由于Exosome还具有另一种含义：外切酶体复合物，具有RNase活性。,分离的产物若没有深入证明它的细胞内来源，应定义为混合的小EVExtracellular Vesicles，即胞外囊泡。,来自多泡内体或MVB的才是exosomes，可检测囊泡与否含内体标志蛋白证明，如CD63。Multivesicular bodies，MVB=MVE Multivesicular endosomes,因此，这些exosomes的功能也许是广义EV的，也也许是真正的exosomes。,下面Thry C的综述中使用广义的EV指没有专门鉴定过大小的囊泡，使用小EV指不不小于200nm的小囊泡。,EV协助癌细胞长出“腿”？,1.肿瘤来源的EV对受体细胞有不一样的作用。在原发性肿瘤位点，EV能稳定细胞突起，增强癌细胞运动能力。EV通过细胞外基质(ECM)局部沉积，增进定向的持续迁移，例如具有纤连蛋白(Fibronectin)的小EV。,2.包括金属蛋白酶(Metalloproteinases)的EV也可以直接参与ECM重构(Remodeling)，使特化的细胞突起具有降解能力，也就是侵入性伪足(Invadopodia)。ECM重构协助肿瘤细胞在组织之间迁移。,3.EV可增进肿瘤基质细胞的分化或募集，如纤维母细胞(Fibroblasts)和骨髓来源细胞(Bonemarrow-derived cells,BMDC)。反过来，周围纤维母细胞分泌的EV可以增强肿瘤细胞迁移能力及耐药性。,4.小EV还能进入循环，从原发肿瘤抵达远端位点。小EV的堆积也许增长血管通透性，EV可以进入远端组织，诱导ECM重构、募集BMDC以及后来的肿瘤细胞，制造转移前微环境(Pre-metastatic niche)。,体内分析EV转移的措施,将标签添加到分泌的EV里,I.将荧光蛋白基因融合到棕榈酰化(Palmitoylation)序列，标识全细胞膜，通过mRNA的新荧光我们可以跟踪结合或内化了EV的细胞,II.膜结合荧光素酶蛋白可以分析体内发光细胞，这样就能捕捉结合EV的荧光素酶蛋白或荧光素酶mRNA,III.用CRE重组酶，检测EV内的mRNA,EV协助小RNA转运？,miRNA分泌进小EV，运送进靶细胞并发挥功能，直接调控miRNA靶标。Pegtel et al,，发现小EV转运EB病毒miRNA到邻近未感染的细胞，克制靶基因。,除了EV包裹的miRNA，miRNA起的作用也有也许是其他EV组分在靶细胞体现内源miRNA引起的。,怎样明确上述两种状况？转运的miRNA是外源基因组编码的，如病毒的(Pegtel et al,)或寄生虫的(Buck et al,)，又或者受体细胞是小鼠的，并没有所研究的miRNA(Alexander et al,)。,EV与免疫,最 近报道发现肿瘤微环境中EV的RNA有着一段特殊的序列(Boelenset al,)：它带有5-triphosphate末端，通过RIG-I感应器被受体细胞基质识别，诱导干扰素应答，跟病毒感染类似。这种应答也参与癌症 细胞对放疗或化疗的应答。,小EV与包膜病毒有相似作用？何种表面分子协助受体细胞膜融合RNA或小分子内含物到细胞 质呢？这个问题有待探索。,外泌体分离和检测,1.,分离,到目前为止，仍没有一种提取措施能同步保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。,1.1,离心法,最常用的措施。搜集细胞培养液后来依次在300g、2000g、10000g离心清除细胞碎片和大分子蛋白质，最终100000g离心得到外泌体。,得到外泌体量多，纯度局限性，电镜鉴定期发现外泌体汇集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定原则，也有某些研究认为此种措施得到的是微泡不是外泌体。,1.2,过滤离心,过滤离心是运用不一样截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜离心分离外泌体。,截留相对分子质量是指能自由通过某种有孔材料的分子中最大分子的相对分子质量。,外泌体是一种囊状小体，相对分子质量不小于一般蛋白质，因此选择不一样大小的MWCO膜可使外泌体与其他大分子物质分离。,这种操作简朴、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度局限性的问题。,1.3,密度梯度离心法,分为持续和不持续梯度离心法。,用于密度梯度离心法的介质规定对细胞无毒，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。试验中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5M和0.25M)配成持续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100000g离心16h，外泌体会沉降到等密度区(1.101.18g/ml)。,用此种措施分离到的外泌体纯度高，不过前期准备工作繁杂，耗时，量少。,1.4,免疫磁珠法,泌体有关抗原的抗体(如CD9、CD63、Alix)与外泌体共同孵育，蒸馏水冲洗后，重悬于PBS缓冲液中。,这种措施可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简朴、不需要昂贵的仪器设备,不过非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的试验。,1.5,色谱法,色谱法是运用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的措施。样品中大分子不能进入凝胶孔，只能沿多孔凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，首先被流动相洗脱出来；小分子可进入凝胶中绝大部分孔洞，在柱中受到更强地滞留，更慢地被洗脱出。,分离到的外泌体在电镜下大小均一，不过需要特殊的设备，应用不广泛。,2.外泌体测量多种措施的比较,2.1,电子显微镜,扫描电子显微镜(SEM)可以直接观测到样品中外泌体的形态。并且SEM具有很高的辨别率，可以鉴别不一样大小的外泌体。,但SEM对样品的预处理和制备上面规定较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量迅速的测量。并且由于外泌体通过了预处理和制备过程，无法精确的进行外泌体浓度的测量。,2.2,动态光散射技术,动态光散射是搜集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过有关仪器将光强的波动转化为有关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，有关曲线衰减较快，大颗粒反之。,在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简朴，只需要简朴的过滤，测量速度较快。,但由于动态光散射技术是测量光强的波动数据，因此大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，因此动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。,2.3纳米微粒追踪分析术,纳米微粒追踪分析术(如下简称NTA)是一种比较新奇的研究纳米颗粒的措施，可以直接和实时的观测纳米颗粒。,NTA通过光学显微镜搜集纳米颗粒的散射光信号，拍摄一段纳米颗粒在溶液中做布朗运动的影像，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。NTA系统的工作原理是将一束能量集中的激光穿过玻璃棱镜对样品(悬浮颗粒的溶液)进行照射(光路图见下图),激光光束从较小角度入射进入样品溶液，照亮溶液中的颗粒。配置相机的光学显微镜，被放置在特定的位置上，搜集视野中被照亮的纳米颗粒发射出的光散射信号。,样品池有大概500微米的深度，采样点激光照亮宽度为20微米，这个数值和光学显微镜的聚焦的视野深度相匹配。相机会进行60秒的影像拍摄，每秒30个采样画面。颗粒的运动过程被NTA软件进行分析。NTA软件在每幅被记录的画面中鉴别和追踪做布朗运动的纳米颗粒由于直接追踪样品中每一种纳米颗粒，因此NTA技术对复杂的样品具有极高的辨别率。为了证明NTA对于复杂样品的辨别能力，我们将100纳米和300纳米两种不一样大小的聚苯乙烯颗粒按照5:1的数量混合，使用NTA进行测量(图3A)。尽管其分布图形有一定的重叠，但两种不一样大小的纳米颗粒的峰清晰的辨别开来。这种对复杂样品的辨别能力对于外泌体这样的研究对象来说是非常重要的。NTA也能对样品浓度进行直接测量。对一系列浓度为1108-8108的100纳米单分散样品进行测量，可以看到NTA测量浓度成果和实际浓度存在着很好的线性有关(图3B)。对于多分散体系，测量成果的精确取决于仪器参数的设定(摄影机快门速度和光圈)，恰当的参数设定可以保证不一样大小颗粒都能被NTA软件追踪和计算。,由于外泌体表面有标志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在复杂的背景环境下(如血清中)，可以用荧光抗体标识外泌体，再用NTA的荧光测量功能实目前复杂背景下对外泌体的测量。,相比较于流式细胞仪的荧光功能，NTA辨别率较高，且测量荧光颗粒的下限可以到达30-40纳米，而流式细胞仪的测量下限为400纳米。虽然对于最新一代的数码流式细胞仪，其测量下限已经到达100纳米，但由于它仍然建立在监测光信号的基础上，因此测量和精确性和辨别率仍然不可靠。因此在外泌体荧光功能测量上，NTA具有独特的优势。,结语,对外泌体作为生物标志物的研究目前仍处在起步阶段，但其在临床应用领域已显示出良好的前景。在临床诊断中，若想在复杂的生物背景下(如血浆，尿液)简朴迅速地测量外泌体浓度，需具有外泌体的大小和表征数据。但目前存在的措施都无法完美的处理这一问题。作为一种相对新的测量技术，NTA具有较高的辨别率，提供实时观测以及精确的浓度测量和荧光测量，对外泌体大小和浓度研究提供了新的思绪。,