基因工程实验-biochemlab.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程实验,生物化学资料网,实验目录,实验一 实验计划表,实验二 染色体,DNA,的提取,实验三,PCR,扩增,实验四 凝胶电泳法回收目的,DNA,及其体外连接,实验五 感受态细胞的制备,实验六 重组质粒的转化,实验七 质粒的提取,实验八 重组质粒的酶切鉴定,实验一 实验计划表,一、实验目的,、了解本学期整体的实验流程及安排。,、熟练使用微量移液器。,、学习制备琼脂糖凝胶。,生物化学资料网,基因工程（,Gene Engineering,）又称重组技术，把不同生物的与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。,基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。,二、实验原理,生物化学资料网,凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套,琼脂糖、,1,TBE,、加样缓冲液,三、实验用具及试剂,目的基因的获取,基因组总提取凝胶电泳检测,扩增目的基因 产物的电泳检测,产物纯化获得目的基因,四、实验操作,1.,本学期实验计划,生物化学资料网,重组、转化,与,pMD18-T,连接,DH5a,感受态细胞制备,转化、平板涂布、培养,筛选与鉴定,抗生素抗性筛选挑单菌落培养提取质粒质粒酶切、电泳检测,2.,微量移液器的使用,将微量移液器按钮轻轻压在第一挡,垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部,缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。,等,1s,后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过,平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、,提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过,然后按吸头弹射器除去吸头,使用操作,生物化学资料网,使用注意事项,未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。,一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。,不要横放带有残留液体吸头的移液器,不要用大量程的移液器移取小体积样品,微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保持弹性。,为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。,生物化学资料网,3.,琼脂糖凝胶制作,选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。,量取,25ml 1TBE,溶液放入锥形瓶或烧杯中,称量,0.25g,琼脂糖，倒入锥形瓶中,将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾,2-3,次，琼脂糖彻底融化,锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中,等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可,掌握酚氯仿法提取的原理和操作。,一、实验目的,实验二基因组总,提取,生物的大部分或几乎全部都集中在细胞核或类核中。,DNA,在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对,DNA,制品的污染常影响到以后的,DNA,操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对,DNA,无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，,DNA,则留在水相，少量的或与,DNA,紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。,DNA,制品中少量的,RNA,无影响，必要时可加入不含,DNase,的,RNase,去除,RNA,污染。,二、实验原理,消化缓冲液,:TE,、,EDTA,、,NaCl,、,SDS,、蛋白酶,K,Tris,平衡酚、氯仿,:,异戊醇,(24:1),，,NaAc,，无水乙醇，,70%,乙醇,三、实验用具与试剂,微量移液器、高速离心机、,1.5ml,管、吸头、烘箱、水浴锅、,1.5ml,管架、胶头滴管、冰箱,、切取组织，剪碎放入研钵,(,越细越好,),，磨成粉末。以消化缓冲液处理,55,水浴过夜，获得组织消化液。,、取出消化组织液，,5000rpm,，,min,，取上清液于新离心管。,、加等体积,ris-,平衡酚，轻轻混匀,min,。,4,、,1000rpm,，,10min,，留上清，取上清液于新离心管。,、加等体积酚,:,氯仿,:,异戊醇,(25:24:1),抽提，轻轻混匀,min,。,、同。,、加等体积氯仿,:,异戊醇，轻轻混匀,min,。,、同。,四、实验步骤,、加,1/10,体积,3mol/LNaAc,，及,.,倍体积预冷（）无水乙醇，混匀。沉淀,min,。,、,12000rpm,，,15min,，弃上清。,、加,70%,乙醇,1ml,，混匀。,、同。,、管放置于烘箱中烘干。,、加,ul TE,或,ddH,2,O,溶解。,、琼脂糖凝胶电泳检测。,提取染色体的基本原理是什么？操作中应该注意什么？,五、思考题,、学习扩增的基本原理。,、掌握技术的常规操作。,、了解扩增的参数设计。,一、实验目的,实验三,扩增,、聚合酶链反应,(Polymerase chain reaction,，,PCR),：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异片段的过程。,、反应体系,引物、,dNTP,、,Mg,、模板、,Taq DNA,聚合酶，,Buffer,。,二、实验原理,、循环参数,9,5min,9,30s,5,30s,72,30s,goto,times,72 10min,Taq DNA,聚合酶，,PCR,缓冲液，,MgCl,2,，,dNTP,，引物，模板，,ddH,2,O,，,TBE,电泳缓冲液，,EB,加样缓冲液,三、实验用具与试剂,旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，,0.2ml PCR,微量离心管，,PCR,仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统,、在,0.2ml PCR,微量离心管中配制,30ul,反应体系。,dd water,20.5ul,10PCR buffer,（不含,MgCl2,）,3ul,25mM MgCl2,2ul,10mmol/L dNTP,1ul,10mol/L Primer 1,1ul,10,mol/L primer 2,1ul,模板,1ul,Taq,酶,0.5u,l,总体积,30ul,四、实验步骤,、在离心机中混匀。,、管放入仪中，按照原理中的条件设置程序，进行反应。,、,PCR,结束后，取,3ul PCR,产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。,五、思考题,PCR,中产生非特异性条带的原因可能有哪些？,实验四 凝胶电泳法回收目的,DNA,及其体外连接,一、实验目的,1.,学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收,DNA,片段的方法。,2.,掌握,DNA,体外连接的方法。,二、实验原理,DNA,分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关,DNA,分子大小,DNA,分子构象,琼脂糖凝胶浓度,电泳所用电压,电泳缓冲液,生物化学资料网,2.,利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附,DNA,，而在低盐浓度时可使,DNA,被洗脱的原理纯化,DNA,。,3.Taq,酶参与,PCR,反应中，产物双链核酸中的,3,端各多连接一个脱氧腺苷酸,A,，与商业开发的,pMD18-T,载体可在,DNA,连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯,1.5ml EP,管，,1.5ml EP,管架，,65,水浴锅,PCR,产物，,1TBE,，加样缓冲液，,TakaRa,胶回收试剂盒，,TA,克隆试剂盒，,DL2000 marker,生物化学资料网,1.2%,琼脂糖凝胶电泳,2.,在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的,DNA,琼脂糖块装在,1.5ml,的,EP,管中称量减,1,克即为凝胶块重量,3.,加入,5,个凝胶体积量的,DR-Buffer,4.,混匀,65,加热融化凝胶块,5.,加入,DR-,Buffer,量的,1/2,体积的,DR-Buffer,当目的片段小于,400bp,再加入终浓度为,20%,的异丙醇,6.,将上述溶液,short,后转移至,spin coloumn,中,12000rpm,1min,弃滤液,7加入,500ul RinseA 12000rpm 30s,弃滤液,8.,加入,700ul RinseB 12000rpm 30s,弃滤液,9.,同,8,四、实验步骤,10.,将,spin coloumn,安置于新的,1.5ml EP,管中 在,spin coloumn,膜中央加,25ulElution Buffer,放入烘箱,1min 12000rpm 1min,保存,1.5ml EP,管,1%,胶检测,11.,链接反应（冰上操作）,在一支,0.2 ml EP,管中加入以下试剂：,纯化的目的,DNA,片段,4.5ul,Vector,0.5ul,连接液,5ul,混匀,16,连接过夜,五、思考题,为什么连接反应的温度要定在,16,度？,生物化学资料网,实验五 感受态细胞的制备,掌握感受态细胞的制备方法,2.,学习和理解影响细胞感受态的因素,一、实验目的,生物化学资料网,感受态是指受体（或者宿主）细胞最易接受外源,DNA,片段并实现其转化的一种生理状态，它是有受体菌的遗传性所决定的。转化过程中所用的受体细胞一般是限制,修饰系统缺陷的变异株，既不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。用,Cacl,2,处理受体细胞，使细胞的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源,DNA,分子进入的感受态细胞。,二、实验原理,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,培养皿，离心管，冷冻高速离心机，超低温冰箱，摇床，锥形瓶,Cacl,2,，,LB Amp,-,液体培养基,，,LB Amp,-,固体培养基，,DH5,甘油菌,1.,先从保存菌种,DH52(-70),划线培,16h(37),2.,从平板中挑取一个单菌落移到,4ml,，,LB Amp,-,培养基中，,37,摇荡过夜,180250rpm,3.,按,1%,的接种量将过夜培养的菌转接于,50ml LB Amp,-,的培养基中，,37,，,250rpm,（,2h2.5h,）,4.,当培养菌生长至,OD,600,达,0.50.6,时（约,22.5h,），将培养菌取出，在无菌条件下将细菌转移至,50ml,无菌聚乙烯离心管中，冰浴,10min,，以使培养液冷至,0,四、实验步骤,5.4,，,5000rpm/min,7min,6.,细胞沉淀用,10ml,冰冷的,Cacl,2,溶液重悬于,4,，,5000rpm/min,，,5min,7.,细胞沉淀用,10ml,冰冷的,Cacl,2,溶液重悬冰上放置,30min,，于,4,，,5000rpm/min,，,5min,8.,用,2ml,冰冷,Cacl,2,溶液重悬各管细胞，然后按每管,100ul,的量分装于预冷的,0.5ml EP,管中存于,-70,生物化学资料网,五、思考题,如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？,生物化学资料网,实验六 重组质粒的转化,一、实验目的,掌握重组质粒的转化方法,生物化学资料网,二、实验原理,1.,转化是将外源,DNA,分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。,2.,化学转化法,利用,Cacl,2,处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于,42,高温热激,90s,，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,水浴锅，培养箱，枪头，冰盒，超净台，微量加样器，制冰机，牙签,DH5,感受态细胞，连接产物，,LB Amp-,液体培养基，,LB Amp+,液体培养基，,LB Amp+,培养基平板,1.5ul,连接液加100ul,感受态细胞（,-70,取出），置冰上，加后轻轻旋动,2.,冰上静置,30min,3.42,水浴,90s,热休克，冰上,3min,4.,加,10ul LB,（,Amp,-,）至菌液，混匀（颠倒）,5.37,烘箱,30min,6.37,，摇床,30min 180rpm,7.,涂平板,100ul/,板，,37,培养,1216h,8.,挑克隆 挑取菌落接入,5ml LB Amp+,液体培养基中，,37,振荡过夜,四、实验步骤,生物化学资料网,五、思考题,当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有,Amp,的,LB,培养基平板前，为什么要在,LB,培养基中培养,1h?,生物化学资料网,实验七 质粒的提取,1.,学习质粒,DNA,提取的基本原理,2.,掌握质粒最常用提取方法,一、实验目的,生物化学资料网,二、实验原理,细菌质粒,DNA,的提取是根据环状质粒,DNA,分子具有相对分子质量较小、易于复性的特点进行的，碱法是常用的提取方法。在热或碱性条件下,DNA,分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体,DNA,不能复性，从而分离质粒,DNA,。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,高速离心机、微量移液器、枪头、凝胶电泳系统，凝胶紫外成像系统，,EP,管,EB,，加样缓冲液，阳性克隆的培养液，质粒提取试剂盒,生物化学资料网,四、实验操作,1取,14ml,过夜培养的阳性克隆菌液，,12000rpm,离心,2min,弃上清,2.,用,250ul,的,solution(,含,RNaseA1),充分悬浮细菌沉淀,3.,加入,250ul,的,solution,轻轻上下翻转混合,56,次使菌体充分裂解，形成透明溶液,4.,加入,400ul,的,4,预冷的,solution,，轻轻上下翻转混合,56,次，直至形成紧实凝集块，室温静置,2min,生物化学资料网,5.,室温,12000rpm,，,10min,，取上清,6.,将试剂盒中的,Spin column,安置于,collection Tube,上,7.,将操作,6,中的上清液转移至,Spin column,中,12000rpm,，,1min,，弃滤液,8.,将,500ul,的,RinseA,加入,Spin column,中，,12000rpm,，,30s,，弃滤液,9.,加,700ul,的,RinseB,加入,Spin column,中，,12000rpm,，,30s,，弃滤液,10.,同,9,生物化学资料网,11.,将,Spin column,安置于新的,1.5ml,离心管上,在,Spin column,膜中央处加入,60ul,灭菌或,Elution Buffer,室温静置,1min,12.12000rpm,，,1min,洗脱,DNA,13.,凝胶电泳检测提取效果，并以空载体做对照，从质粒大小上初步判断是否有外源基因进入载体,生物化学资料网,五、思考题,在碱法提取质粒,DNA,操作过程中应该注意哪些问题？,生物化学资料网,实验八 重组质粒的酶切鉴定,1.,学习和掌握限制性内切酶的特性,2.,了解重组质粒的鉴定方法，重点掌握重组质粒的酶切鉴定方法,一、实验目的,生物化学资料网,二、实验原理,1.,限制性核酸内切酶：是一类能识别双链,DNA,分子特异性核酸序列的,DNA,水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是,DNA,重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定,生物化学资料网,2.,影响核酸限制性内切酶活性的因素,DNA,的纯度；,DNA,的甲基化程度；,酶切消化反应的温度；,DNA,的分子结构；,溶液中离子浓度及种类；,缓冲液的,pH,值。,生物化学资料网,三、实验用品及试剂,恒温水浴锅、微量加样器、枪头、凝胶电泳系统、凝胶成像系统,酶,Hind,III,和,BamH,I,核酸内切酶（,Takara,）,，,Hind,III,和,BamH,I,酶解缓冲液,(10,通用,buffer),，琼脂糖，,pMD18-T,质粒，加样缓冲液,生物化学资料网,四、实验步骤,对初步确定有外源基因进入的质粒用限制性内切酶进行切割，进行进一步的鉴定,重组质粒,DNA 10ul,ddH,2,O 7ul,10,通用缓冲液,2ul,BamH I,（,10U/ul,）,0.5ul,Hind III,（,10U/ul,）,0.5ul,总体积,20ul,2.37,保温,0.5-1h,3.,利用空载体与目的基因片段为对照，对酶切后的片段进行比对，从酶切后的片段的数目及大小上进行确认,五、思考题,除了酶切鉴定重组质粒外，还可以选用何种方法鉴定？,