动物实验操作.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,大鼠生物学特性,大鼠汗腺极不发达，仅在爪垫上有汗腺，尾巴是散热器官。,大鼠无呕吐反应，对许多药物易产生耐药性。,对营养缺乏敏感，可发生典型的缺乏症状。,大鼠无胆囊，胆汁通过总胆管进入十二指肠。,大鼠神经系统与人类相似。,动物实验基本技能,编号与标记方法,大鼠的抓取,大鼠麻醉,供试品给予方法,采集体液,大鼠的采血,一、编号与标记方法,染色法,穿耳孔法,标牌法,烙印法,剪毛法,在每组动物不超过,l0,只或一个实验不超过,40,只的情况下适用,实验动物：大鼠、小鼠,染色剂：,3-5,苦味酸溶液，可染成黄色,染色法：,单色涂染法,涂染原则：从左到右、从上到下,左前肢为,1,号、左侧腹部,2,号、左后肢,3,号，,两耳后部,4,号、背部,5,号、后肢背部,6,号，,右前肢,7,号、右侧腹部,8,号、右后肢,9,号,头部为,40,号、尾巴根为,10,号。,方法步骤,在每组动物不超过,100,只的情况下适用,实验动物：大鼠、小鼠,常用染色剂：,3-5,苦味酸溶液，可染成黄色，作为,“,个,”,位数,常用染色剂：,0.5%,中性红或品红溶液，可染成红色，作为,“,十,”,位数,染色法：,双色涂染法,用两种颜色同时进行染色标记,用苦味酸,(,黄色,),染色标记作为个位数，个位数的染色标记方法同单色涂染法,用品红,(,红色,),染色标记作为十位数,方法步骤,左前肢为,10,号、左侧腹部,20,号、左后肢,30,号,两耳后部,40,号、背部,50,号、后肢背部,60,号,右前肢,70,号、右侧腹部,80,号、右后肢,90,号,第,100,号不作染色标记,方法步骤,穿耳孔法,：用专用耳空器在动物耳朵不同部位打一小孔或缺口表示一定号码的方法。原则是：左耳代表十位，右耳代表个位。实验动物：兔、犬、猪,标牌法,：一般挂在动物的颈部、耳朵、脚上。实验动物：犬、猴,烙印法,剪毛法,其它方法,器材：,大鼠饲养盒,+,面罩,1,套,方法步骤：,首先戴好防护手套,用右手拇指和食指抓住小鼠尾巴中部将大鼠提起，放在大鼠饲养盒的面罩上,左手顺势按、卡在大鼠躯干背部，稍加压力向头颈部滑行,以左手拇指和食指捏住大鼠两耳后部的头颈皮肤，其余三指和手掌握住大鼠背部皮肤，完成抓取固定,二、大鼠的抓取,动物全身麻醉分四期：,第一期：,随意兴奋期，出现运动与运动失调,第二期：,不随意兴奋期，由意识完全丧失至规则的自动呼吸开始时止,第三期：,外科麻醉期,第四期：,延髓麻醉期，进入此期，麻醉已严重过量,三、实验动物麻醉,麻醉方法：全身麻醉和局部麻醉，通过吸入、注射（静脉、皮下、肌肉、腹腔）、口服、灌胃等方法使动物麻醉,常用麻醉药物：乙醚（吸入），戊巴比妥钠、硫贲妥钠、氯胺酮（静脉），普鲁卡因、利多卡因（局麻）,麻醉方法与麻醉药,种类,戊巴比妥,硫贲妥钠,盐酸氯胺酮,水合氯醛,乌拉坦,mg/kg,途径,mg/kg,途径,mg/kg,途径,mg/kg,途径,mg/kg,途径,小鼠,35,50,IV,IP,25,50,I.V.,IP,22-44,IM,400,IP,-,-,大鼠,25,50,IV,IP,20,40,IV,IP,22-44,IM,300,IP,0.75,IP,豚鼠,30,40,IV,IP,20,55,IV,IP,22-44,IM,200-300,IP,1.5,IP,家兔,30,40,IV,IP,20,IV,22-44,1.0,IV,IP,狗,30,IV,25,IV,125,IV,1.0,IV,猪,45kg,30-20,15,IV,IV,10-9,5,IV,IV,10-15,10-15,IM,IM,常用麻醉药剂量与注射途径,麻醉前应禁食,8h,以上,麻醉前应准确称体重,注意麻醉剂量,麻醉过程中注意观察动物的反应情况,注意保温,静脉注射时必须缓慢，,在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平,注意事项,原理：,是使用非挥发性麻醉药对动物进行全麻术的方法,器材：,3,戊巴比妥钠、注射器,大鼠的麻醉,用左手将大鼠捉持保定，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部,右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺,针头刺入皮下后进针,3mm,左右，接着使注射针头与皮肤呈,45,度角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失,固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液,大鼠麻醉步骤,经口给药,注射给药,1.,皮下注射给药,2.,皮内注射给药,3.,肌肉注射给药,4.,静脉注射给药,5.,腹腔注射给药,四、供试品给予方法,自动口服给药,灌胃给药,:,是借器械将药物直接灌入动物胃内的方法，此法可以准确控制给药量，但如果操作不当易造成动物死亡,经口给药,将灌胃针连接在注射器上，吸入一定量的药液,操作前，大致量一下从口到胃的距离，估计灌胃针头插入的深度,左手捉持动物，使头部向上；,右手持针，把灌胃针头的前端放进动物的口腔，顺着上腭部插入咽部，顺咽后壁轻轻往下推，灌胃针会顺着食管滑入动物的胃内，,此时没有抵触感,用右手食指将针栓慢慢往下压，将注射器中的药液灌入动物的胃中,灌胃给药,剂量：小鼠约,0.1-0.5ml,10g,体重，最大体积为,1.0ml/,只；大鼠约,1-2 ml,100g,体重，最大体积为,1.0ml/,只,注意：在灌胃过程中，避免误插入气管,灌胃给药,1.,皮下注射给药,原理：将药液注入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环,器材：,1m1,注射器,1,支、生理盐水、烧杯、酒精、碘酒、棉球,注射给药,注射部位：颈背部、腋下、腹侧和后肢的皮下,常规消毒注射部位的皮肤，用注射针头取一,锐角角度,刺入皮下,.,将针头轻轻向左右摆动，,易摆动,则表示已刺入皮下，再轻轻,抽吸,，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。,注射量：,0.01ml,0.03ml,g,体重,皮下注射方法步骤,此法用于观察皮肤血管通透性变化或皮肤反应,注射部位：动物背部，脱毛，用针头平直进入皮内,注射药液后，皮肤表面鼓起小泡，停片刻拔出针头,2.,皮内注射给药,原理：,将药液注入动物的肌肉组织，经毛细血管吸收进入血液循环,器材：,1ml,注射器,1,支、生理盐水、烧杯、酒精、碘酒、棉球,注射部位：,一般选择肌肉丰富而无大血管通过的臀部或大腿外测，回抽无血即可注射,3.,肌肉注射给药,原理：将药液注入小鼠的尾静脉,器材：,1m1,注射器,1,支、生理盐水、烧杯、金属笼或大小鼠器、酒精、碘酒、棉球,4.,静脉注射给药,将大小鼠放在金属笼或,小鼠固定器,中，通过金属笼或,大小鼠固定器,的孔拉出鼠尾巴,用左手捏住鼠尾巴中下部，用,75,酒精棉球反复擦拭尾部；,注射时，以左手拇指和中指捏住鼠尾两侧，用食指从下面托起尾巴，以无名指夹住尾巴的末梢。,右手持,4,号针头的注射器，使针头与静脉平行,(,小于,30,度角,),；,从鼠尾巴下,1/4,处进针，仔细观察，如果无阻力，无白色皮丘出现，说明已刺入血管，即可注入药物,拔出针头后，用干棉球压住注射部位约,l-2min,，防止出血,注射量：小鼠,0.005m1,0.01 m1,g,体重。,大鼠,1.0-2.0,m1,100,g,体重,静脉注射方法步骤,原理：,将药液注入大鼠的腹腔,器材：,注射器,1,支、生理盐水、烧杯,5.,腹腔注射给药,用左手将大鼠捉持保定，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部；,右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺,针头刺入皮下后进针,3mm,左右，接着使注射针头与皮肤呈,45,度角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失,固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液,注射量：,0.01,0.02m1,g,体重,腹腔注射方法步骤,胸水,腹水,消化液,尿液,骨髓液,动物精液,乳汁,五、采集体液,代谢笼法,:,此法较常用于大、小鼠，成熟小鼠尿量,1-3ml/24h,，大鼠为,55-75ml/24h,导尿法：,常用于雄兔、犬等动物，要轻度麻醉，可以采到无污染的尿液,压迫膀胱法：,此法适用于兔、猫、犬等大动物,输尿管插管法,膀胱插管法,膀胱穿刺法,剖腹采尿法,反射排尿法,尿液的采集,眼眶后静脉丛,(,窦,),取血,器材：毛细管,(,玻璃或塑料均可,),、,1,肝素溶液、干燥皿、乙醚、试管、干棉球,六、大鼠的采血,先将毛细管浸泡在,1,肝素溶液中数分钟，取出干燥备用,将大鼠进行麻醉，使大鼠保持侧卧位,左手拇指、食指抓住两鼠耳之间的颈部头皮，并轻轻向下压迫颈部两侧，致大鼠静脉血,回流障碍，眼球外突，眶后静脉丛充血,右手持毛细管由大鼠的目内眦部插入结膜，使毛细管与眶壁平行地向喉头方向推进，深度约,3,5mm,轻轻旋动毛细管，使其穿破静脉丛，让血流顺毛细管流出,采血量：,0.4,0.6ml,次,方法步骤,脑立体定位技术,某些颅外标记与颅内结构具有相对固定的位置关系，确定脑内功能核团的位置,核团微量注射,电位引导,核团的刺激或损毁,脑立体定位仪,脑立体定位仪的调试,:,摆稳定位仪，用水平仪测水平。,检验电极移动架上各个轴向滑尺是否保持互相垂直，,微量注射器针尖是否光滑垂直。,检查定位仪各衔接部位的螺丝有无松动。,检查头部固定装置两侧是否对称。,检查耳杆使两耳杆尖端相对,以此判定耳杆固定的准确程度。,鼠颅的固定,:,将麻醉大鼠置于脑立体定位仪上，鼠颅依靠两耳杆及切牙钩三点固定。,脑立体定位仪坐标“,0”,点的测得,:,按照,Paxinos,大鼠脑立体定位图谱，以颅骨前囟即冠矢点作为前后方向的“,0”,参照点，当微量注射器的针尖对准冠矢点时,读取立体定位仪三维坐标上标尺的数值，此数值即是“,0”,点坐标。,生物信号在体检测遥控系统,Illustration of the high fidelity recording provided by the C10 telemeter,which allows for the accurate measurement of pulse pressures in mice despite their high heart rate(10 per second!).,Bursts of renal sympathetic nerve activity made in a conscious,freely behaving rat 64 days following telemeter implantation,PowerLab,系统,Faraday cage,Vibration Isolation Table,Microscope,Micro-Manipulators Remote Controller,Amplifiers,CCD Camera,膜片钳系统,Micro-Manipulators,DAD-VC system,CCD Camera,活体生物发光和荧光成像技术,58,理想的光源：萤火虫荧光素酶（,luciferase）,基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。,活体生物发光成像系统原理,遗传学标记,实时、原位,多波长检测,标记癌细胞,标记细菌,标记转基因鼠,59,荧光素酶的表达,将,荧光素酶,基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使,荧光素,酶得到持续表达。,启动子,染色体,体内表达,外源注入,底物,活跃细胞,体内发光,60,活体成像技术的主要应用,标记细胞,癌症及药物研究,标记病毒,DNA,RNA,病毒学及基因治疗,转基因动物模型,蛋白质相互作用、代谢、发育、内分泌学，等等,标记基因,siRNA,研究的应用,干细胞,免疫,其它,细胞凋亡,组织特异性基因表达,标记细菌,61,体内药物分析的生物发光检测,1,x10,6,，,PC-3M-Luc,肿瘤细胞，皮下注射,14天,21天,28天,35天,雄性,SCID,小鼠,处理方式 细胞数,无治疗对照 2.2,x10,9,5-,FU,治疗 2.8,x10,8,丝裂酶素 3.6,x10,6,治疗,小鼠#6,n=7,小鼠#40,n=8,(,从第11天开始给药),小鼠#31,n=8,(,从第11天开始给药),62,乳腺癌原位接种,PNAS 2010,10,63,U87,脑胶质瘤成像,cancer research 2011,8,PTA of U87 human,gliomas in mouse brains.A,representative bioluminescence,images of nude mice bearing,U87-TGL tumors with different,treatments(see Materials and,Methods).,64,肿瘤转移,65,基因治疗载体的构建,AdTSTA-FL,的表达活性比,AdCMV-FL,高,100,倍以上,AdTSTA-FL,（,10,7,）,AdCMV-FL,（,10,7,）,Days 5 7 10 13,800,600,400,200,500,400,300,200,100,10,3,10,5,谢 谢,