锁核酸相关文献.doc

, 《生理科学进展》 2003年04期
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锁核酸研究进展
李生茂  徐祥  梁华平  李磊  
【摘要】：锁核酸 (lockednucleicacid ,LNA)是一种新型的寡核酸衍生物 ,结构中 β D 呋喃核糖的 2’ O ,4’ C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥 ,呋喃糖的结构锁定在C3’内型的N构型 ,形成了刚性的缩合结构。LNA作为一种新的反义核酸 ,具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点。LNA在基因诊断和基因治疗上有很多优势 ,如 :单链核酸的多态性基因分型、LNA寡聚体具有高效抑制端粒酶活性及LNA修饰的DNA核酶 (LNAzymes)高效清除高级结构的RNA等 ,有良好的应用研究前景
【作者单位】： 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室
【关键词】： 锁核酸 核苷酸衍生物 寡聚核苷酸
【基金】：国家重点基础研究发展规划项目(G19990 5 4 2 0 3) 国家自然科学基金( 30 170 36 7) 全军“十五”课题基金( 2 0 0 1～ 2 0 0 5 )资助课题
【分类号】：R341
【正文快照】：
反义核酸药物是药学研究的新领域 ,有希望成为分子水平治疗各种疾病如艾滋病、病毒感染、癌症、炎症反应及心血管疾病、慢性感染性疾病和遗传性疾病等新的突破口 ,正受到世界范围内的广泛重视。 1978年 ,Zemecnik等首先根据碱基互补配对原则 ,设计反义寡核苷酸用于基因治疗的

《生物化学与生物物理进展》 2003年03期
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锁核酸的特点及其应用
李生茂  徐祥  梁华平  李磊  
【摘要】：
【作者单位】： 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室
【关键词】：锁核酸 第三军医大学 野战外科 亚甲基 酸衍生物 解的稳定性 治疗各种疾病 寡核苷酸 热稳定性 呋喃核糖
【分类号】：R341
【正文快照】：
近期 ,锁核酸 (lockednucleicacid ,LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在药学研究领域引起了人们的广泛关注 ,有希望成为分子水平治疗各种疾病的新突破口 .它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物 ,结构中含有一个或多个2′ O ,4′ C 亚甲基 β D 呋喃核糖核酸单体 ,核糖的 2′ O位

当前位置: 首页 > 期刊 > 《中国现代医生》 > 2010年第11期 > 正文编号:11899111应用锁核酸探针技术检测肿瘤样本中K-ras基因突变(2)
2010年4月15日 章 伟 钟 翔 夏献颗
1.2.5 测序 对SSCP发现有异常片段的DNA 随机抽取进行正反双向DNA 测序。同时针对LNA探针检测有突变的PCR产物进行克隆后测序确认。

2 结果

2.1 LNA探针检测和PCR-SSCP检测及测序结果

应用LNA探针荧光PCR方法检测,对照组样本均未发现K-ras基因12密码子突变。85例组织样本中,25例胃癌组织样本检出10例突变(40%),28例直肠癌样本中检出13例突变(46.4%),22例结肠癌样本中检出11例突变(50%),10例胰腺癌样本6例检出突变(60%)。97例肿瘤血浆样本中,30例胃癌血浆样本检出8例有突变(26.7%),32例直肠癌血浆样本检出11例有突变(34.4%),25例结肠癌血浆样本检出12例有突变(48%),10例胰腺癌血浆样本5例检出突变(50%)。随机测序结果表明LNA探针检测突变正确。突变型LNA探针检测结果如图1所示。

应用PCR-SSCP方法检测,对照组样本均未发现K-ras基因12密码子突变。85例组织样本中,25例胃癌组织样本检出9例突变(36%),28例直肠癌样本中检出11例突变(39.3%),22例结肠癌样本8例检出突变(36.4%),10例胰腺癌样本5例检出突变(50%)。97例肿瘤血浆样本中,30例胃癌血浆样本检出6例有突变(20%),32例直肠癌血浆样本检出8例有突变(25%),25例结肠癌血浆样本检出11例有突变(44%),10例胰腺癌血浆样本4例检出突变(40%)。随机测序结果表明SSCP方法检测突变正确。PCR-SSCP检测结果如图2所示。

2.2 LNA探针-荧光PCR 法检测敏感性

将12密码子突变型K-ras质粒[(102～107)拷贝/ L]与一定量的12密码子野生型K-ras质粒按一定比例(1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000)混合,然后进行荧光PCR 反应,结果LNA探针检测可以稳定地检出突变型K-ras质粒为10拷贝,检测的灵敏度为1:1000。

3 讨论

近年来,K-ras基因突变的检测被作为肿瘤诊断和治疗预后的一项重要指标,在临床实验室中已经广泛开展,应用的方法也较多,检测的样本主要包括肿瘤组织样本、血浆及粪便等[2-6]。既往研究表明[7-9],现有一些方法存在灵敏度差等问题,同时也不利于高通量样本同时进行检测,所以发展出更为快速、简便并且非常敏感的K-ras基因检测方法,对临床意义重大 ......

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应用锁核酸探针技术检测肿瘤样本中K-ras基因突变
2010-06-06 11:13　来源: 作者： 网友评论 0 条 浏览次数 185

　[摘要] 目的 应用锁核酸探针技术检测肿瘤样本中K-ras基因突变,探讨其诊断价值。方法 结合锁核酸TaqMan探针与实时荧光PCR 技术建立K-ras基因突变快速检测法,与传统聚合酶链反应-单链构象多态性分析法( PCR-SSCP)及测序结果进行比较,评价新方法的诊断价值。结果 锁核酸探针PCR 法可对肿瘤样本中K-ras基因突变进行有效检测,操作简便;可在104倍的野生型K-ras基因背景下检测出突变,灵敏度为0.1%,可检测突变基因最低限为10拷贝/ mL,相对应传统方法,本方法可同时进行较大规模的样品检测,更快捷和灵敏。结论 锁核酸探针实时荧光PCR法较PCR-SSCP法有明显优势,适用于大规模临床样本的K- ras基因突变检测,可作为肿瘤筛查和预后判断有效手段。
　　[关键词] 锁核酸; K-ras; 荧光PCR; PCR-SSCP
　　[中图分类号] R730.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)11-86-03

　　　　近期,锁核酸(locked nucleic acid,LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物引起了人们的广泛关注。由于LNA 和核苷酸在结构上有很大的相似性,故其对DNA、RNA 有很好的识别能力和强大的亲和力。与其它寡核酸类似物相比,LNA 有很多优点,如和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性,Tm值可升高3~8℃;具有抗3'脱氧核苷酸酶降解的稳定性;高效的自动寡聚化作用,合成方法简单等[1]。K-ras基因的突变与胃癌、胰腺癌、结直肠癌密切相关,结、直肠癌患者K-ras点突变率达40%～50%,且点突变几乎皆位于12,13和61密码子,其中大多数突变点位于12密码子。本研究即通过LNA探针荧光PCR方法检测肿瘤样本和血浆中K-ras基因的突变,了解LNA探针检测方法的优越性。
　　1 材料和方法
　　1.1 临床资料
　　收集本院肿瘤组织样本85例,其中胃癌组织样本25例,直肠癌样本28例,结肠癌样本22例,胰腺癌样本10例。收集肿瘤血浆样本97例,胃癌血浆样本30例,直肠癌样本32例,结肠癌样本25例,胰腺癌样本10例。所有患者均经手术、病理证实。另取20 例正常人样本为对照组。
　　1.2 方法
　　1.2.1 取材 肿瘤组织样本为术中切取新鲜肿瘤组织1cm×1cm×1cm,立即放入-80 ℃冰箱储存备用。抽取肿瘤患者外周静脉血5mL,以EDTA抗凝,1000g离心,提取血浆储存于-80℃冰箱中备用。
　　1.2.2 DNA提取 ①取1g 冷藏的肿瘤组织浸入液氮中,待组织结冻,将其捣碎,置入研钵中,加入少许液氮,研磨至粉末状。应用QIAamp DNA Mini Kit进行组织样本中DNA提取。②将冷藏的血浆自然解冻后,应用QIAamp MinElute Virus Spin Kit进行血浆样本中DNA提取。
　　1.2.3 LNA探针-荧光PCR检测 针对K-ras基因位于12密码子的突变点,应用Premier Biosoft International公司Beacon Designer7.0软件设计引物和探针。PCR反应总体积为50μL,Qiagen公司Hot-Star热启动酶1.5U,KCl和(NH4)2SO4混合缓冲液,MgCl 25.0mM,dNTPs 0.2mM,引物浓度200nmol/L,探针浓度为150nmol/L,其中突变型LNA探针用FAM标记,野生型LNA探针用HEX标记,淬灭基因都用BHQ1,模板5μL。反应条件为95℃ 15min热启动;94℃变性30s,55℃退火45s,共45循环。应用ABI7500进行扩增反应和荧光信号检测。
　　1.2.4 PCR-SSCP 应用Primer Primier5.0设计K-ras基因12密码子突变扩增引物 PCR 反应总体积为50μL,Qiagen公司Hot-Star热启动酶1.5U,KCl和(NH4)2SO4混合缓冲液,MgCl 21.5mM,dNTPs 0.2mM,引物浓度200nmol/L,模板5μL。反应条件为95℃ 15min热启动;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共35循环。应用ABI9700 PCR仪进行扩增反应。应用Bio-Rad公司垂直板电泳仪进行PCR产物变性后电泳,对电泳胶进行银染。 　1.2.5 测序 对SSCP发现有异常片段的DNA 随机抽取进行正反双向DNA 测序。同时针对LNA探针检测有突变的PCR产物进行克隆后测序确认。
　　2 结果
　　2.1 LNA探针检测和PCR-SSCP检测及测序结果
　　应用LNA探针荧光PCR方法检测,对照组样本均未发现K-ras基因12密码子突变。85例组织样本中,25例胃癌组织样本检出10例突变(40%),28例直肠癌样本中检出13例突变(46.4%),22例结肠癌样本中检出11例突变(50%),10例胰腺癌样本6例检出突变(60%)。97例肿瘤血浆样本中,30例胃癌血浆样本检出8例有突变(26.7%),32例直肠癌血浆样本检出11例有突变(34.4%),25例结肠癌血浆样本检出12例有突变(48%),10例胰腺癌血浆样本5例检出突变(50%)。随机测序结果表明LNA探针检测突变正确。突变型LNA探针检测结果如图1所示。
　　应用PCR-SSCP方法检测,对照组样本均未发现K-ras基因12密码子突变。85例组织样本中,25例胃癌组织样本检出9例突变(36%),28例直肠癌样本中检出11例突变(39.3%),22例结肠癌样本8例检出突变(36.4%),10例胰腺癌样本5例检出突变(50%)。97例肿瘤血浆样本中,30例胃癌血浆样本检出6例有突变(20%),32例直肠癌血浆样本检出8例有突变(25%),25例结肠癌血浆样本检出11例有突变(44%),10例胰腺癌血浆样本4例检出突变(40%)。随机测序结果表明SSCP方法检测突变正确。PCR-SSCP检测结果如图2所示。
　2.2 LNA探针-荧光PCR 法检测敏感性
　　将12密码子突变型K-ras质粒[(102～107)拷贝/ L]与一定量的12密码子野生型K-ras质粒按一定比例(1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000)混合,然后进行荧光PCR 反应,结果LNA探针检测可以稳定地检出突变型K-ras质粒为10拷贝,检测的灵敏度为1:1000。
　　3 讨论
　　近年来,K-ras基因突变的检测被作为肿瘤诊断和治疗预后的一项重要指标,在临床实验室中已经广泛开展,应用的方法也较多,检测的样本主要包括肿瘤组织样本、血浆及粪便等[2-6]。既往研究表明[7-9],现有一些方法存在灵敏度差等问题,同时也不利于高通量样本同时进行检测,所以发展出更为快速、简便并且非常敏感的K-ras基因检测方法,对临床意义重大。
　　本研究将锁核酸探针技术和实时荧光PCR技术结合,与传统的PCR-SSCP方法进行比较,同时对检测的结果进行测序验证,结果发现新建立的方法具有灵敏度高的特点,可以一次反应把野生型和突变型完全分开;同时由于直接闭管操作,减少了配胶、电泳以及测序等过程,使得检测程序变得极为简便易行,也最大限度地减少了污染的可能性,降低假阳性率。最后检测的灵敏度可达0.1%,检测突变的最低拷贝数可到10拷贝/mL。
　　综上所述,本实验提供了一种快速、敏感的K-ras基因突变检测方法,应用此方法进行K-ras 基因检测有望成为肿瘤筛查和预后判断的有效手段;而且通过对LNA探针的广泛应用,该方法也能够用于检测其他基因的缺失或插入突变。
　　[参考文献]
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接：
中华微生物学和免疫学杂志
CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY
2007 Vol.27 No.11 P.977-982

锁核酸捕获TaqMan探针实时PCR和PCR-RFLP检测乙型肝炎病毒基因变异的研究
余文辉　 周小梅　 周大桥　 李顺民　 贺劲松　 李爱娣　
摘　要：目的 评价锁核酸捕获TaqMan探针实时聚合酶链反应(PCR)和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测乙型肝炎病毒(HBV)基因变异的特点.方法 分别用直接测序法、锁核酸(LNA)捕获TaqMan探针实时PCR和PCR-RFLP检测77例接受拉米夫定(LAM)治疗6个月以上的慢性乙型肝炎患者的血清样本.结果 锁核酸捕获TaqMan探针实时PCR和PCR-RFLP都能检测HBV野生型YMDD及其变异型YIDD和YVDD.此外,两种方法尚能鉴定HBV野生型和变异型混合种群.更为重要的是,在检测HBV野生型和变异型共生变异方面,锁核酸捕获TaqMan探针实时PCR比PCR-RFLP更敏感、更省时.结论 锁核酸捕获TaqMan探针实时PCR是一种检测HBV YMDD变异的灵敏度和特异性都高的快速法,在监测HBV患者LAM抗病毒治疗的疗效及发现新耐药病毒基因型等方面具有广泛的应用前景.
关键词：聚合酶链反应;YMDD基因;乙型肝炎病毒;变异;限制性片段长度多态性;锁核酸
Gene mutations of hepatitis B virus were detected by locked nucleic acid-mediated TaqMan probes real-time PCR and PCR-RFLP
YU Wen-hui　 ZHOU Xiao-mei　 ZHOU Da-qiao　 LI Shun-min　 HE Jing-song　 LI Ai-di　

基金项目：深圳市科技计划项目(200603200)
作者简介：余文辉,Email:whyuchina@,电话:[phone] 通讯作者
作者单位：余文辉（518033,深圳市中医院）　
　　　　　周小梅（518033,深圳市中医院）　
　　　　　周大桥（国家级肝病重点专科）　
　　　　　李顺民（518033,深圳市中医院）　
　　　　　贺劲松（国家级肝病重点专科）　
　　　　　李爱娣（518033,深圳市中医院）　
参考文献：
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[6]李生茂,徐祥,梁华平,等.锁核酸的特点及其应用.生物化学与生物物理进展,2003,30(3):400.
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收稿日期：2006年12月13日
出版日期：2007年11月30日
学术期刊 > 广东医学 > 2011年1期 > 锁核酸探针实时荧光定量PCR检测HBV基因变异
锁核酸探针实时荧光定量PCR检测HBV基因变异
DOI：
摘要：
目的 描述并评价锁核酸(locked nucleic acid,LNA)探针实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测乙型肝炎病毒(HBV)204位基因突变的方法及特点.方法 分别用直接测序法、LNA探针实时荧光定量PCR检测109例接受拉米夫定(LAM)治疗6个月以上的慢性乙型肝炎患者的血清样本.结果 LNA探针实时荧光定量PCR能检测HBV野生型YMDD和其突变型YVDD、YIDD,而且这种方法还可以检测HBV野生型和变异型的混合.LNA探针相比普通探针在检测野生型和突变型混合样本方面更敏感,区分度更好.结论 LNA探针实时荧光定量PCR检测YMDD变异具有快速、灵敏等特点,可以用于大量临床样本的快速筛查,在监测拉米夫定治疗疗效及发现新耐药突变型等方面具有广泛的应用前景.
作者：
江洁    丁渭    陈华云    何琼    何蕴韶
作者单位：
江洁(中山大学中山医学院基础医学院,广州,510080)
丁渭,陈华云,何琼,何蕴韶(中山大学达安基因股份有限公司,广州,510665)
期 刊：
广东医学   ISTICPKU
Journal：
GUANGDONG MEDICAL JOURNAL
年，卷(期)：
2011, 32(1)
分类号：
R4
关键词：
锁核酸探针    荧光定量PCR    YMDD    乙型肝炎病毒    拉米夫定耐药突变   
机标分类号：
R44 R73
机标关键词：
核酸探针  实时荧光定量  PCR检测  荧光定量聚合酶链反应  野生型  突变型  慢性乙型肝炎患者  拉米夫定  LNA  乙型肝炎病毒  血清样本  方法  nucleic acid  直接测序法  real-time  HBV  治疗疗效  应用前景  特点  基因突变  
基金项目：
国家科技部863计划项目
参考文献(16条)
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