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PCRPCR1.PCRPCR（Polymerase Chain Reaction)Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应，又称DNADNA体外扩增技术。19851985年由美国PE-CetusPE-Cetus公司的MullisMullis等人发明，荣获19931993年度诺贝尔化学奖。2.DNADNA半保留复制的机理；体外DNADNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。PCRPCR的基本原理3.PCRPCR扩增体系模板（TemplateTemplate）：基因组、质粒DNADNA、cDNAcDNA，也可以是细菌、组织样品等。引物（PrimerPrimer）：确定扩增目的序列的特异性；确定扩增产物长度。DNADNA聚合酶（DNA PolymeraseDNA Polymerase）：推动PCRPCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。缓冲液（BufferBuffer）：控制体系的pHpH和离子强度，为DNADNA聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸（dNTPdNTP）：DNADNA的基本组成元件，包括dATPdATP、dGTP dGTP、dCTP dCTP、dTTP dTTP。MgMg2+2+、K K+、增强剂4.1.1.变性：高温使双链DNADNA解离形成单链（9595，30s30s）。2.2.退火：低温下，引物与模板DNADNA互补区结合（4545 6565，30s30s）。3.3.延伸：中温延伸。DNADNA聚合酶催化以引物为起始点的DNADNA链延伸反应（7272，3030 60s 60s）。PCRPCR的基本原理5.6.7.高温变性8.低温退火9.中温延伸10.11.12.13.理论：2 2n n递增（n n为循环次数），如果扩增3030循环，目标DNADNA可增加2 23030也就是10109 9倍。实际：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行3030个循环后，扩增倍数一般可达10106 6 10107 7。14.PCRPCR扩增曲线1.1.早期（E E期）:引物在单链DNADNA模板上搜索互补序列 ，并与特定位点杂交。2.2.中期（M M期）：扩增反应顺利进行，产物呈指数型增长。3.3.晚期（L L期）：平台期，DNADNA聚合酶过度损耗或者产物的抑制。15.PCRPCR扩增条件循环16.PCRPCR反应条件9494 5min5min9494 30s30s56.256.2 30s30s7272 30s30s7272 7min7min4 4 PC1-P20PC1-P20：模板：基因组DNADNA；产物：506bp506bp举个例子PCRPCR体系（10 L10 L）模板：1 L1 L上游引物：0.2 L0.2 L下游引物：0.2 L0.2 LEasy Taq Easy Taq 酶：0.1 L0.1 LEasy Taq BufferEasy Taq Buffer：1 L1 LdNTPdNTP：0.8 L0.8 LddHddH2 2O O：6.7 L6.7 L3030个循环17.1.1.避免PCRPCR试剂的污染2.2.最适合的反应条件3.3.设置对照组：PCRPCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。PCRPCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。PCRPCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。PCRPCR的注意事项18.1.1.为什么完全没有PCRPCR扩增产物？试剂质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。PCRPCR仪温度控制不精确。模板DNADNA发生降解。引物或反应温度设计不合理靶片段GCGC含量过高或扩增对象长常见问题19.2.2.为什么出现多条非特异性条带？反应体系被污染。引物特异性差。退火温度不合适。常见问题20.3.3.为什么PCRPCR产物很少？聚合酶活性过低。循环次数偏低。模板DNADNA浓度过低。常见问题21.4.4.为什么PCRPCR产物出现片状拖尾？DNADNA聚合酶过多或酶活性差。dNTPdNTP和MgMg2+2+浓度过高。退火温度过低，PCRPCR循环数偏多。模板DNADNA用量过大或模板DNADNA不纯。引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特异扩增。常见问题22.普通PCRPCR仪温度梯度PCRPCR仪23.实时荧光定量PCRPCR仪24.引物设计25.为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNADNA序列。引物是PCRPCR特异性反应的关键，同时也与PCRPCR扩增的效率密切相关。引物设计的最重要的原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计的目的26.1 1、引物应具有足够的特异性。如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNADNA序列，则需要考虑目的DNADNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。引物与非特异序列的同源性不超过70%70%或有连续8 8个互补碱基。NCBI Primer BLASTNCBI Primer BLAST 引物设计的基本原则27.2 2、避开易形成二级结构的模板序列区域。分子内互补、发夹结构、分子间互补。二级结构会增加引物与模板杂交以及PCRPCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区域。用有关软件预测mRNAmRNA的稳定二级结构。引物设计的基本原则28.29.3 3、引物长度一般为18-3018-30个碱基之间。引物长度与反应的特异性和解链温度成正相关。过短：扩增特异性下降过长：引物自身形成二级结构，以及引物二聚体。引物设计的基本原则30.4 4、G+CG+C含量一般为40%-60%40%-60%引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。G+CG+C含量过低：引物解链温度低，引物易于从模板上解离。G+CG+C含量过高：引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。引物设计的基本原则31.5 5、T Tm m值之差应小于1 1，最适退火温度在55-6055-60。一对引物的TmTm值差过大可直接导致PCRPCR扩增效率下降或失败。对于20bp20bp左右的引物：T Tm m（）=2=2（A+TA+T）+4+4（G+CG+C）一般情况下，PCRPCR的最佳退火温度比引物T Tm m值低5 5左右。引物设计的基本原则32.6 6、引物中四种碱基最好是随机分布的 避免4 4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。特别是引物的33端不应有连续3 3个G G或C C，否则会使引物在G+CG+C富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。引物设计的基本原则33.7 7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身互补发夹结构 引物之间互补二聚体 引物自身连续互补碱基不应超过3 3个，引物之间连续互补碱基不应超过4 4个，尤其避免33端的互补重叠。引物设计的基本原则34.8 8、引物的55端可以修饰，33端不可以修饰。引物的55端决定着PCRPCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。由于延伸是从33端开始的，所以不能进行任何修饰。引物设计的基本原则35.9 9、引物的33端不可以A A结尾。引物33端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T T时，错配的引发效率大大降低，G G、C C错配的引发效率介于A A、T T之间，所以33端最好选择T T。引物设计的基本原则36.1010、引物33端要避开密码子的第3 3位。如扩增序列位于基因编码区域，引物33端不要终止于密码子的第3 3位，因密码子的第3 3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。引物设计的基本原则37.1 1、避免重复碱基，尤其是G G。2 2、引物退火温度在58-6058-60之间。3 3、G+CG+C为30-80%30-80%。4 4、33端最后5 5个碱基内不能有多于2 2个的G G或C C。5 5、引物的产物大小一般在80-250bp80-250bp之间；80-150 bp80-150 bp最为合适（可以延长至300 bp300 bp）。Real-Time PCRReal-Time PCR引物设计原则38.6 6、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。7 7、Real-Time PCRReal-Time PCR引物的扩增产物应跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，以避免基因组DNADNA污染影响。Real-Time PCRReal-Time PCR引物设计原则39.Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0Oligo 6Oligo 6Primer 3Primer 3（在线）Primer-BLASTPrimer-BLAST（在线）引物设计常用软件40.File New DNA sequenceFile New DNA sequence粘贴模板序列41.42.引物搜索43.引物位置产物大小引物长度44.45.46.47.48.49.50.OligoOligo51.52.53.54.55.Primer BLASTPrimer BLAST56.57.58.59.60.逆转录PCRPCR61.由一条RNARNA单链转录为互补DNADNA（cDNAcDNA）称作逆转录PCRPCR（Reverse Reverse Transcription PCRTranscription PCR，RT-PCRRT-PCR），由依赖RNARNA的DNADNA聚合酶（逆转录酶）来完成。逆转录PCRPCR的原理62.逆转录PCRPCR的原理63.逆转录PCRPCR的反应体系1 1、模板RNARNA2 2、逆转录酶3 3、逆转录引物64.65.66.67.93-9693-96，较高的温度变性更快更彻底，尤其是对富含G+CG+C的靶序列而言。68.退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。退火温度可以通过计算推断，通常采用温度梯度PCRPCR的方法进行摸索。45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 MPC1-P20 PC1-P20 退火温度摸索69.延伸的温度通常为所以DNADNA聚合酶的最适工作温度，一般为7272；延伸的时间主要取决于目的片段的大小，不同种类的聚合酶的合成效率也不同，因此还与DNADNA聚合酶的种类有关。Easy Taq Easy Taq：1-2kb/min1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min FastPfu:2-4kb/min FastPfu:2-4kb/min70.循环数：在其他参数都已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。一般情况下30-3530-35个循环即可。循环数太多：会增加非特异扩增产物的数量和复杂性。循环数太少：PCRPCR产量太低。71.逆转录引物：（1 1）随机六聚核苷酸引物 仅长6 6个核苷酸，每个核苷酸位点上随机加入4 4中不同的脱氧核苷酸，因此是4 46 6中不同引物的集合体。所有RNARNA分子均可以充当模板，合成的cDNAcDNA中有96%96%来自rRNArRNA。72.逆转录引物：（2 2）OligoOligo（dTdT）仅由dTTPdTTP构成，长度一般为18-18-2424个核苷酸。识别mRNAmRNA的33端polypoly（A A）尾，因此仅mRNAmRNA可被逆转录。73.逆转录引物：（3 3）特异性引物 能与目标RNARNA碱基序列互补的寡核苷酸引物，仅产生待分析基因的cDNAcDNA。74.半定量 RT-PCR75.基本概念半 定 量 RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。定量RT-PCR（quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。76.灰度值（IOD值）用凝胶成像系统自带的分析软件分析目的条带的平均密度值，也称为灰度值。是densitydensity和areaarea的乘积。平台效应 PCRPCR扩增属于酶促反应，所以，DNADNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNADNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNADNA片段的逐渐积累，当引物-模板/DNA/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNADNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。管家基因 持家基因(house-keeping(house-keeping genes)genes)：又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNARNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。77.基本原理 PCRPCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促动力学原理，开始的循环内扩增产物呈指数积累，产物与模板呈线性关系。半定量RT-PCRRT-PCR技术正是利用产物与模板量的这一线性关系，通过扩增产物来对比总RNARNA中目的基因的表达。78.基本流程79.注意的问题RNA的提取做RTRT前必需测RNARNA浓度，常用500ng500ng或1ug1ug。A260/A280A260/A280和A260/A230A260/A230A260/A280A260/A280在1.8-2.01.8-2.0时，认为RNARNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，当用TrisTris作为缓冲液检测吸光度时，R R值可能会大于2 2（一般应该是2.22.2的）。当R1.8R2.2R2.2时，说明RNARNA已经水解成单核酸了。A230A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230A260/A230的比值大于2.0 2.0。如果RNARNA样品的260/280=1-1.5,260/230=1-1.5260/280=1-1.5,260/230=1-1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。如果RNARNA样品的260/280=2260/280=2，260/2301260/2301，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。80.注意的问题RNA的电泳图谱一般的，RNARNA的电泳都是用变性胶进行的，但是如果仅仅是为了检测RNARNA的质量，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S28S和18S18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA mRNA 的完整性。一般的，如果28S28S和18S18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S28S的亮度在18S18S条带的两倍以上，RNARNA的质量是好的。注意的问题81.注意的问题引物设计所设计引物的扩增效率和特异性要好，一般选择在基因的cdscds区域设计引物，在可能的情况下将PCRPCR引物置于基因的不同外显子上以消除基因和mRNAmRNA的共线性。注意的问题82.注意的问题内参的选择为了客观地比较不同样本中目标基因表达量的相对多少，消除由于反转录时总RNARNA浓度差异造成的误差，要选择合适的ControlControl基因。经常用于RT-RT-PCRPCR法的ControlControl有：GAPDHGAPDH、-actin-actin、18S rRNA18S rRNA、28S rRNA28S rRNA等83.注意的问题同管扩增或异管扩增的选择同管扩增的优点：保证扩增效率一致。缺点：两种基因相互竞争，会影响扩增的进程。分管扩增的优点：保证每个基因的扩增进程优化。缺点：扩增效率不能保证一致。注意的问题84.注意的问题PCR循环数的确定最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。actinactin和GAPDH28-30GAPDH28-30，否则增加模板量注意的问题85.注意的问题其他扩增条件固定（时间）循环数、循环时间、变性时间、退火和延伸、升降温的速度体系固定（PCRmixPCRmix）dNTPsdNTPs、引物、反应模板、DNADNA聚合酶PCRPCR仪固定凝胶浓度EBEB浓度梳子的选择扫胶（曝光）注意的问题86.结果分析将要比较的两个样品的内参调成一样的亮度；根据扩增内参时加入的cDNAcDNA量，进行目标基因的PCRPCR扩增；电泳扫描后，计算灰度值，先用一个标本的目标和内参进行比较，然后用这个相对值再去和其他你所要比较的平行组进行比较，一般每组3 3个样本以上。结果分析87.实时荧光定量PCR技术介绍(Real time Quantitative PCR)88.实时荧光定量PCR定义 在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 89.实时荧光定量PCR PCR 原理 实时原理 常 规 PCRPCR技术：对PCRPCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCRPCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过CtCt值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析90.实时荧光定量PCRPCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、CtCt值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析91.实时荧光定量PCR PCR 原理 -扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件92.实时荧光定量PCR PCR 原理 -荧光阈值荧光信号阈值 （threshold threshold）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段q 真正的信号:荧光信号超过域值93.实时荧光定量PCR PCR 原理 -Ct值CtCt值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value 94.实时荧光定量PCR PCR 原理 -Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量CtCt值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性95.实时荧光定量PCR PCR 原理 -标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量96.非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan 3、Molecular Beacon 实时荧光定量PCR PCR 原理 -DNA-DNA 产物的荧光标记97.实时荧光定量PCR PCR 方法 1-1-SYBR Green 法98.SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 99.实时荧光定量PCRPCR原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理100.实时荧光定量PCR PCR 方法 2-2-Taqman探针法101.实验方法 Real Time PCR严格上可以区分为DNA起始的Real Time PCR和RNA起始的Real Time RT-PCR。102.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I 熔解曲线分析熔解曲线分析103.SYBR Green SYBR Green 法 融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物104.Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量105.SYBR Green 法 -引物设计106.SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同107.SYBR Green 法 -PCR反应性的确认108.SYBR Green 法 -PCR条件优化109.SYBR Green SYBR Green 法 优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点110.荧光定量PCRPCR的解析方法绝对定量qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample25111.荧光定量PCRPCR的解析方法绝对定量112.荧光定量PCRPCR的解析方法相对定量113.荧光定量PCRPCR的解析方法荧光定量PCRPCR的解析方法相对定量114.荧光定量PCRPCR的解析方法相对定量115.荧光定量PCRPCR的解析方法相对定量对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-delta CtDelta-delta Ct法更为简单。116.荧光定量PCRPCR的解析方法相对定量117.荧光定量PCRPCR的解析方法Comparative Delta-delta CtComparative Delta-delta Ct法的特点1.Comparative 1.Comparative Delta-delta Delta-delta CtCt法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCRPCR扩增即可。2.2.每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。用Comparative Comparative Delta-delta Delta-delta CtCt法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M M值的差小于0.10.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Comparative Delta-delta Delta-delta CtCt法进行相对定量分析。反之，如果M M差值大于0.10.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.10.1，二是换用其它的相对定量方法。荧光定量PCRPCR的解析方法相对定量118.荧光定量PCRPCR的解析方法相对定量119.2-Ct法120.www.tw-谢谢！121.