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一、一、PCR的定义：的定义：PCR（polymerase chain reaction)：聚合酶链式反应，又称体外聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增扩增技术。技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。片段的技术。2.DNADNA扩增的传统方法：扩增的传统方法：扩增的传统方法：扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到选，牵扯到选，牵扯到选，牵扯到DNADNA酶切、连接、转化、培养及探针杂酶切、连接、转化、培养及探针杂酶切、连接、转化、培养及探针杂酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但交等技术，虽然技术上已无难点，但交等技术，虽然技术上已无难点，但交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需操作复杂，需操作复杂，需操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及数周到数月的时间，且不利于普及数周到数月的时间，且不利于普及数周到数月的时间，且不利于普及。3.PCRPCR技术：技术：技术：技术：1985198519851985年由美国年由美国年由美国年由美国 Cetus Cetus 公司的公司的公司的公司的Kary Kary MullisMullis 首创，可以将微量目的首创，可以将微量目的首创，可以将微量目的首创，可以将微量目的DNADNA片段扩增一百片段扩增一百片段扩增一百片段扩增一百万倍以上。万倍以上。万倍以上。万倍以上。优点：优点：优点：优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便好以及快速简便好以及快速简便好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、等，广泛应用于微生物学、考古学、等，广泛应用于微生物学、考古学、等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。对目的基因进行分析、鉴定。对目的基因进行分析、鉴定。对目的基因进行分析、鉴定。Kary MullisKary Mullis 本人因此获本人因此获本人因此获本人因此获1993199319931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。4.二、二、PCR的原理：的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的用于扩增位于两段已知序列之间的用于扩增位于两段已知序列之间的用于扩增位于两段已知序列之间的DNADNA片段，片段，片段，片段，类似于天然类似于天然类似于天然类似于天然DNADNA的复制过程。的复制过程。的复制过程。的复制过程。以拟扩增的以拟扩增的以拟扩增的以拟扩增的DNADNA分子为模板，以一对分别与模分子为模板，以一对分别与模分子为模板，以一对分别与模分子为模板，以一对分别与模板板板板5 5 5 5末端和末端和末端和末端和3 3 3 3末端互补的寡核苷酸片段为引物，末端互补的寡核苷酸片段为引物，末端互补的寡核苷酸片段为引物，末端互补的寡核苷酸片段为引物，在在在在DNADNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的着模板链延伸直至完成新的着模板链延伸直至完成新的着模板链延伸直至完成新的DNADNA合成，重复这一过合成，重复这一过合成，重复这一过合成，重复这一过程，即可使目的程，即可使目的程，即可使目的程，即可使目的DNADNA片段得到扩增。片段得到扩增。片段得到扩增。片段得到扩增。5.扩增的特异性取决于引物与模板扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异的特异结合结合，基本反应步骤分三步：，基本反应步骤分三步：1.变性变性(Denaturation)：加热使模板加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两双链间的氢键断裂而形成两条单链。条单链。94 302.退火退火(复性复性)(Annealling):突然降温后模板突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。发生在模板与引物之间。55 30 6.3.3.延伸延伸延伸延伸(Extension):(Extension):将反应温度调节到将反应温度调节到将反应温度调节到将反应温度调节到酶的最适温度酶的最适温度，在，在，在，在DNADNA聚合聚合聚合聚合酶、酶、酶、酶、4 4种种种种 dNTPs dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的及镁离子等存在的条件下，以引物的及镁离子等存在的条件下，以引物的及镁离子等存在的条件下，以引物的 3 3 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNADNA链。链。链。链。72 1 上述上述上述上述 3 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本步为一个循环，每经过一个循环，样本步为一个循环，每经过一个循环，样本步为一个循环，每经过一个循环，样本中的中的中的中的DNADNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新量应该增加一倍，新形成的链又可成为新量应该增加一倍，新形成的链又可成为新量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过一轮循环的模板，经过一轮循环的模板，经过一轮循环的模板，经过25254040个循环后个循环后个循环后个循环后DNADNA可扩增可扩增可扩增可扩增10106 6 10 109 9 倍。倍。倍。倍。7.PCR 的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C8.双链双链DNA分子分子9.双链断开双链断开 循环循环110.模板与引物结合模板与引物结合循环循环1TaqTaq11.循环循环1TaqTaq12.循环循环113.循环循环114.双链断开双链断开循环循环215.模板与引物结合模板与引物结合循环循环2TaqTaqTaqTaq16.循环循环217.9494变性变性双链断开双链断开循环循环318.循环循环3TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq19.循环循环320.循环循环n21.PCRPCR扩增的特异性扩增的特异性扩增的特异性扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所是由一对寡核苷酸引物所是由一对寡核苷酸引物所是由一对寡核苷酸引物所决定的决定的决定的决定的。反应初期，原来的。反应初期，原来的。反应初期，原来的。反应初期，原来的DNADNA担负起使模板的担负起使模板的担负起使模板的担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，片段急剧增多而成为主要模板，片段急剧增多而成为主要模板，片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物最终的扩增产物最终的扩增产物最终的扩增产物是介于两种引物是介于两种引物是介于两种引物是介于两种引物5 5 端之间的端之间的端之间的端之间的DNADNA片段片段片段片段。22.三、三、PCR的成分和作用：的成分和作用：终浓度终浓度 1.1.缓冲液：缓冲液：缓冲液：缓冲液：10 50 50 mM Tris-Cl(pH8.4)维持维持维持维持 Taq Taq 酶作用环境的偏碱性酶作用环境的偏碱性酶作用环境的偏碱性酶作用环境的偏碱性 25 25 50 mM KCl 促进引物退火，促进引物退火，促进引物退火，促进引物退火，50 mM 50 mM 会抑制会抑制会抑制会抑制 Taq Taq 酶的活性。酶的活性。酶的活性。酶的活性。100g/ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)(BSA)对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的用，建议使用乙酰化的用，建议使用乙酰化的用，建议使用乙酰化的 BSA BSA。明胶、。明胶、。明胶、。明胶、Tween-20Tween-20、二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇(DTT)(DTT)也有类似作用。也有类似作用。也有类似作用。也有类似作用。23.2.MgCl2:1.5 2.0 mM Taq 酶具有酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。降。24.3.dNTPs:dATP dATP、dGTP dGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP底物底物底物底物 0.02 0.02 0.2 mM dNTPs dNTPs 可与可与可与可与 Mg Mg2+2+结合，应注意结合，应注意结合，应注意结合，应注意MgMg2+2+浓度与浓度与浓度与浓度与dNTPs dNTPs 浓度之间的关系，浓度之间的关系，浓度之间的关系，浓度之间的关系，Mg Mg2+2+浓度比浓度比浓度比浓度比 dNTPs dNTPs 浓度高浓度高浓度高浓度高 0.2 0.2 2.5 mM 2.5 mM。过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。率和室验成本。率和室验成本。率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。25.4.引物引物(Primer-P)：预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。0.2 1 M 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。偏低：产量降低。26.5.Taq DNA 聚合酶：聚合酶：耐高热耐高热 0.5 5 U/100 l 1U/25 50l 偏高：引物非特异产物的扩增偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低偏低：产物量降低27.6.模板模板DNA(Template):最低最低102 105 bp DNA片段，实际用量远远片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。超过此量，用量需在实验中摸索。1 5 l 过高：非特异产物增加过高：非特异产物增加 过低：产量降低过低：产量降低7.水：水：去离子水，补足整个反应体积。去离子水，补足整个反应体积。28.四、四、PCR反应体系：反应体系：常用常用30l 各种成分的实际用量应根据实验者选各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。度进行核算。29.10buffer：130/10=3l MgCl2:1.530/25=1.8l dNTPs:0.230/10=0.6l 引物引物 P：0.4302/10=2.4l Taq 酶酶(5U/l)：1/5=0.2l 模板：模板：1l 水：水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21l30.操作：操作：5 5份标本份标本份标本份标本 总体积总体积总体积总体积 30l 6=180l 30l 6=180l 1.1.取一取一取一取一 0.5 ml Ep 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂：管，依次加入下列试剂：管，依次加入下列试剂：管，依次加入下列试剂：10buffer 10buffer：3l 6=18l 3l 6=18l MgCl MgCl2 2:1.8l6=10.8l:1.8l6=10.8l dNTPs:0.6l6=3.6l dNTPs:0.6l6=3.6l 引物引物引物引物 P P：2.4l 6=14.4l 2.4l 6=14.4l Taq Taq 酶酶酶酶(5U/l)(5U/l)：0.2l 6=1.2l 0.2l 6=1.2l 水：水：水：水：21l 6=126l 21l 6=126l 共共共共174l174l，先用移液器，先用移液器，先用移液器，先用移液器/指弹混匀，后用离心机瞬时指弹混匀，后用离心机瞬时指弹混匀，后用离心机瞬时指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。混匀（管壁上液体沉至管底）。混匀（管壁上液体沉至管底）。混匀（管壁上液体沉至管底）。31.2.2.另取另取另取另取 5 5 支支支支0.2ml Ep0.2ml Ep管，分别加入上述液体管，分别加入上述液体管，分别加入上述液体管，分别加入上述液体2929l。3.3.分别取标本模板各分别取标本模板各分别取标本模板各分别取标本模板各1 1l，加入上述加入上述加入上述加入上述5 5支支支支 Ep Ep 管中，混匀，管中，混匀，管中，混匀，管中，混匀，分别加入分别加入分别加入分别加入2 2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。响反应体积），离心机瞬时离心，备用。响反应体积），离心机瞬时离心，备用。响反应体积），离心机瞬时离心，备用。4.4.反应条件：反应条件：反应条件：反应条件：PCRPCR扩增仪扩增仪扩增仪扩增仪 94309430，55 30 55 30，72 172 1，35 35个循环，个循环，个循环，个循环，72 72 延伸延伸延伸延伸 5 5。32.五、五、PCR反应条件优化：反应条件优化：1 1、温度、循环参数：、温度、循环参数：、温度、循环参数：、温度、循环参数：变性温度和时间：变性温度和时间：变性温度和时间：变性温度和时间：保证模板保证模板保证模板保证模板DNADNA解链完全是保证整个解链完全是保证整个解链完全是保证整个解链完全是保证整个PCRPCR扩增成扩增成扩增成扩增成功的关键功的关键功的关键功的关键。加热加热加热加热90909595，30 30 60 s 60 s，再复杂的，再复杂的，再复杂的，再复杂的DNADNA分子分子分子分子也可变性为单链。根据模板也可变性为单链。根据模板也可变性为单链。根据模板也可变性为单链。根据模板DNADNA复杂程度，可以调复杂程度，可以调复杂程度，可以调复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择整变性温度和时间。一般情况下选择整变性温度和时间。一般情况下选择整变性温度和时间。一般情况下选择94 94 30 30，可，可，可，可使各种复杂的使各种复杂的使各种复杂的使各种复杂的DNADNA分子完全变性。分子完全变性。分子完全变性。分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对温度过高或高温持续时间过长，可对温度过高或高温持续时间过长，可对温度过高或高温持续时间过长，可对TaqTaq酶活性酶活性酶活性酶活性和和和和dNTPdNTP分子造成损害。分子造成损害。分子造成损害。分子造成损害。33.复性温度和时间：复性温度和时间：复性温度和时间：复性温度和时间：PCRPCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板扩增特异性取决于复性过程中引物与模板扩增特异性取决于复性过程中引物与模板扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。的结合。的结合。的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和复性温度的选择，可根据引物的长度和复性温度的选择，可根据引物的长度和复性温度的选择，可根据引物的长度和G+CG+C含含含含量确定，长度在量确定，长度在量确定，长度在量确定，长度在15 15 25 bp 25 bp 之间时，复性温度之间时，复性温度之间时，复性温度之间时，复性温度 Tm=Tm=4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于计算得到，一般位于计算得到，一般位于计算得到，一般位于40 40 60 60，30 30 60 s 60 s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。低，产物特异性越低。低，产物特异性越低。低，产物特异性越低。一般情况下选择一般情况下选择一般情况下选择一般情况下选择55 3055 30，足以使引物与模板，足以使引物与模板，足以使引物与模板，足以使引物与模板之间完全结合。之间完全结合。之间完全结合。之间完全结合。34.延伸温度和时间：延伸温度和时间：延伸温度和时间：延伸温度和时间：一般位于一般位于一般位于一般位于TaqTaq酶最适作用温度酶最适作用温度酶最适作用温度酶最适作用温度70 70 75 75 之间。之间。之间。之间。引物小于引物小于引物小于引物小于1616个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到物与模板的结合，可以缓慢升温到物与模板的结合，可以缓慢升温到物与模板的结合，可以缓慢升温到70 70 75 75。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，1Kb 1Kb 1Kb需加长延伸时间，需加长延伸时间，需加长延伸时间，需加长延伸时间，10Kb10Kb片段延伸时间可达片段延伸时间可达片段延伸时间可达片段延伸时间可达1515分钟。分钟。分钟。分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，常用延伸时间过长可出现非特异扩增，常用延伸时间过长可出现非特异扩增，常用延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 172 1。35.循环数：循环数：循环数：循环数：其他参数选定后，其他参数选定后，其他参数选定后，其他参数选定后，PCRPCR循环次数主要取决于循环次数主要取决于循环次数主要取决于循环次数主要取决于模板模板模板模板DNADNA的浓度。的浓度。的浓度。的浓度。理论上说理论上说理论上说理论上说20 20 25 25次循环后，次循环后，次循环后，次循环后，PCRPCR产物的积累产物的积累产物的积累产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到不可能达到不可能达到不可能达到100%100%，因此不管模板浓度是多少，因此不管模板浓度是多少，因此不管模板浓度是多少，因此不管模板浓度是多少，20 20 30 30次次次次是比较合理的循环次数。是比较合理的循环次数。是比较合理的循环次数。是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。循环次数越多，非特异扩增增加。循环次数越多，非特异扩增增加。循环次数越多，非特异扩增增加。36.2、MgCl2浓度：浓度：可显著影响可显著影响PCR的产量及产物特异性的产量及产物特异性 1.5 2.0 mM 过高：增加非特异扩增并影响产率过高：增加非特异扩增并影响产率 过低：酶活性显著下降。过低：酶活性显著下降。37.3、引物：、引物：0.2 1 M 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物 之间形成引物二聚体，产量降低。之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。偏低：产量降低。引物设计原则：引物设计原则：总原则是提高扩增的效率和特异性总原则是提高扩增的效率和特异性38.引物设计原则引物设计原则 长度长度长度长度151530 b30 b，过短特异性降低，过长则成本增加，过短特异性降低，过长则成本增加，过短特异性降低，过长则成本增加，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。产量也下降。产量也下降。产量也下降。引物碱基尽可能随机分布引物碱基尽可能随机分布引物碱基尽可能随机分布引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆，避免出现嘌呤、嘧啶堆，避免出现嘌呤、嘧啶堆，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物积现象，引物积现象，引物积现象，引物 G+C G+C 含量宜在含量宜在含量宜在含量宜在45 45 55%55%左右。左右。左右。左右。引物内部不能含有自身互补序列引物内部不能含有自身互补序列引物内部不能含有自身互补序列引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹，否则会形成发夹，否则会形成发夹，否则会形成发夹样二级结构，样二级结构，样二级结构，样二级结构，两个引物之间尤其在两个引物之间尤其在两个引物之间尤其在两个引物之间尤其在 3 3 末端不应有互末端不应有互末端不应有互末端不应有互补链存在补链存在补链存在补链存在，不然会形成引物二聚体。，不然会形成引物二聚体。，不然会形成引物二聚体。，不然会形成引物二聚体。39.引物设计原则引物设计原则 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)(70%)或少于连续或少于连续或少于连续或少于连续8 8个的互补碱基个的互补碱基个的互补碱基个的互补碱基。要求在引物设计时采用。要求在引物设计时采用。要求在引物设计时采用。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。计算机进行辅助检索分析。计算机进行辅助检索分析。计算机进行辅助检索分析。引物的引物的引物的引物的 5 5 末端碱基末端碱基末端碱基末端碱基：并没有严格的限制并没有严格的限制并没有严格的限制并没有严格的限制，只要与模，只要与模，只要与模，只要与模板板板板DNADNA结合的引物长度足够，其结合的引物长度足够，其结合的引物长度足够，其结合的引物长度足够，其 5 5 末端碱基可以不末端碱基可以不末端碱基可以不末端碱基可以不与模板与模板与模板与模板DNADNA匹配呈游离状态。最多可游离匹配呈游离状态。最多可游离匹配呈游离状态。最多可游离匹配呈游离状态。最多可游离1010个碱基个碱基个碱基个碱基并不影响并不影响并不影响并不影响PCRPCR反应进行。反应进行。反应进行。反应进行。40.引物设计原则引物设计原则 引物的引物的引物的引物的 3 3 末端碱基末端碱基末端碱基末端碱基：原则上要求引物的原则上要求引物的原则上要求引物的原则上要求引物的3 3 末端与末端与末端与末端与模板模板模板模板DNADNA一定要配对一定要配对一定要配对一定要配对，另外，另外，另外，另外 3 3 末端的末位碱基在末端的末位碱基在末端的末位碱基在末端的末位碱基在很大程度上影响着很大程度上影响着很大程度上影响着很大程度上影响着 Taq Taq 酶的延伸效率。酶的延伸效率。酶的延伸效率。酶的延伸效率。引物引物引物引物3 3 末末末末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选差异，最好选差异，最好选差异，最好选T T、G G、C C，而不选，而不选，而不选，而不选A A。41.六、六、PCR扩增产物的分析扩增产物的分析 1 1、凝胶电泳分析法凝胶电泳分析法凝胶电泳分析法凝胶电泳分析法：聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳，用于探讨用于探讨用于探讨用于探讨PCRPCR扩增的灵敏度效果好，但配制复杂，扩增的灵敏度效果好，但配制复杂，扩增的灵敏度效果好，但配制复杂，扩增的灵敏度效果好，但配制复杂，常用琼脂糖凝胶电泳常用琼脂糖凝胶电泳常用琼脂糖凝胶电泳常用琼脂糖凝胶电泳。2 2、点杂交、点杂交、点杂交、点杂交 3 3、微孔板杂交法、微孔板杂交法、微孔板杂交法、微孔板杂交法42.七、七、PCR技术的主要用途技术的主要用途 1 1、目的基因的克隆目的基因的克隆目的基因的克隆目的基因的克隆：PCRPCR技术为在重组技术为在重组技术为在重组技术为在重组DNADNA过程中获得目的基过程中获得目的基过程中获得目的基过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。因片段提供了简便快速的方法。因片段提供了简便快速的方法。因片段提供了简便快速的方法。2 2、基因的体外突变基因的体外突变基因的体外突变基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段可以随意设计引物在体外对目的基因片段可以随意设计引物在体外对目的基因片段可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。进行嵌和、缺失、点突变等改造。进行嵌和、缺失、点突变等改造。进行嵌和、缺失、点突变等改造。43.3 3、DNADNA和和和和RNARNA的微量分析：的微量分析：的微量分析：的微量分析：PCRPCR技术高度敏感，对模板的含量技术高度敏感，对模板的含量技术高度敏感，对模板的含量技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是要求很低，是要求很低，是要求很低，是DNADNA和和和和NANA微量分析的最好方微量分析的最好方微量分析的最好方微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足胞已足以满足胞已足以满足胞已足以满足PCRPCR的检测需要，因此在基因诊的检测需要，因此在基因诊的检测需要，因此在基因诊的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。断方面具有极广阔的应用前景。断方面具有极广阔的应用前景。断方面具有极广阔的应用前景。4 4、DNADNA序列测定：序列测定：序列测定：序列测定：PCRPCR技术的引入使技术的引入使技术的引入使技术的引入使DNADNA测序工作大大简化，测序工作大大简化，测序工作大大简化，测序工作大大简化，也提高了测序的速度。也提高了测序的速度。也提高了测序的速度。也提高了测序的速度。5 5、基因突变分析：基因突变分析：基因突变分析：基因突变分析：利用利用利用利用PCRPCR与一些技术的结合可以大大提高与一些技术的结合可以大大提高与一些技术的结合可以大大提高与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。基因突变检测的敏感性。基因突变检测的敏感性。基因突变检测的敏感性。44.45.