常用饲用酶制剂检测方法介绍.ppt

几种酶制剂检测方法介绍几种酶制剂检测方法介绍饲料酶制剂饲料酶制剂 现市场上常见的饲料酶制剂多为复合酶，其现市场上常见的饲料酶制剂多为复合酶，其成分木聚糖酶、成分木聚糖酶、-淀粉酶、（酸性或中性）蛋白淀粉酶、（酸性或中性）蛋白酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、-葡聚糖葡聚糖酶酶中的几中的几种。种。如何准确如何准确检测检测其中的一种其中的一种酶酶制制剂剂的活性？的活性？酶制剂检测原理酶制剂检测原理 酶与一般催化剂最主要的区别之一是它具有高度的专一性有高度的专一性。酶制剂检测原理酶制剂检测原理 样品检测：样品检测：酶制剂检测应用酶对底物专一性的特点，采用酶制剂检测应用酶对底物专一性的特点，采用高纯度底物，专一检测某种酶制剂对底物的降高纯度底物，专一检测某种酶制剂对底物的降解，然后测定产物含量（分光光度计）。解，然后测定产物含量（分光光度计）。标准曲线：标准曲线：通过用其高纯度的产物制作标准曲线，通过分通过用其高纯度的产物制作标准曲线，通过分光光度计的读数查出对应的产物含量，然后计光光度计的读数查出对应的产物含量，然后计算酶活。算酶活。酶制剂检测原理酶制剂检测原理A.-淀粉酶淀粉酶 1.碘淀粉显色法 利用淀粉遇碘变蓝的反应，检测出未被淀粉酶利用淀粉遇碘变蓝的反应，检测出未被淀粉酶分解的淀粉，运用分光光度计测定碘反应蓝值的分解的淀粉，运用分光光度计测定碘反应蓝值的变化，然后查表读取酶活。变化，然后查表读取酶活。特点：测定特点：测定-淀粉酶的碘淀粉显色法是专一性较高、操淀粉酶的碘淀粉显色法是专一性较高、操作较简便、准确性也较高的方法。作较简便、准确性也较高的方法。A.-淀粉酶淀粉酶 2.DNS显色法 原理：原理：淀粉淀粉酶酶水解淀粉生成的麦芽糖，将水解淀粉生成的麦芽糖，将3 3，55二硝基水二硝基水杨杨酸酸试剂还试剂还原生成原生成33氨基氨基55硝基硝基水水杨杨酸的酸的显显色基色基团团，在一定范，在一定范围围内其内其颜颜色的深色的深浅与糖的浅与糖的浓浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。度成正比，故可求出麦芽糖的含量。特点：专一性不高，易受其他淀粉酶（主要是特点：专一性不高，易受其他淀粉酶（主要是-淀粉酶）淀粉酶）的干扰，因此，碘淀粉显色法应用较多。的干扰，因此，碘淀粉显色法应用较多。B.蛋白酶蛋白酶 1.1.FolinFolin法法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，产生酪氨酸等酚基氨原理：蛋白酶水解酪蛋白，产生酪氨酸等酚基氨基酸，在碱性条件下，酚基氨基酸与基酸，在碱性条件下，酚基氨基酸与FolinFolin试剂反试剂反应生产蓝色物质，于应生产蓝色物质，于680680nmnm比色测定光吸收值，比色测定光吸收值，计算酶活力。计算酶活力。该法的准确性及灵敏度都较高，在国内已得到该法的准确性及灵敏度都较高，在国内已得到公认，是应用最广的方法，我国的部颁标准及各公认，是应用最广的方法，我国的部颁标准及各大酶制剂生产企业都采用该法。大酶制剂生产企业都采用该法。B.蛋白酶蛋白酶 2.紫外分光光度法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，产生酪氨酸等酚基氨原理：蛋白酶水解酪蛋白，产生酪氨酸等酚基氨基酸，利用酪氨酸基酸，利用酪氨酸在在280280nmnm处有特征性吸收峰处有特征性吸收峰,测测定计算酶活。定计算酶活。特点：紫外线操作比特点：紫外线操作比FolinFolin法简便，但灵敏度仅为法简便，但灵敏度仅为FolinFolin法的法的1/101/10。C.产还原糖酶制剂产还原糖酶制剂 现今采用的还原糖法通常是比色法，现今采用的还原糖法通常是比色法，黄色黄色的的3,5-3,5-二硝基水二硝基水杨杨酸（酸（DNSDNS）试剂试剂与与还还原糖在原糖在碱性条件下共碱性条件下共热热后，自身被后，自身被还还原原为为棕棕红红色的色的3-3-氨基氨基-5-5-硝基水硝基水杨杨酸。酸。显色反应与不同聚合度显色反应与不同聚合度同源寡糖还原性末端的含量成正比同源寡糖还原性末端的含量成正比。特特点点：易易于于操操作作，价价格格低低廉廉，方方便便快快速速，重重复复性好性好 C.产还原糖酶制剂产还原糖酶制剂 能产生还原糖的酶有：包括能产生还原糖的酶有：包括纤维素酶纤维素酶、半纤维半纤维素酶素酶和和淀粉酶淀粉酶等。等。半纤维素酶是分解半纤维素半纤维素酶是分解半纤维素(包括各种降戊糖与包括各种降戊糖与聚己糖聚己糖)的一类酶的总称的一类酶的总称,主要包括主要包括-葡聚糖酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。C.产还原糖酶制剂产还原糖酶制剂 1.还原糖法 2.粘度法 3.琼脂平板扩散法 4.可溶性的染色底物1.还原糖法还原糖法 还还原糖是指含有自由原糖是指含有自由醛醛基或基或酮酮基的糖基的糖类类，单单糖都是糖都是还还原糖原糖，双糖和多糖不一定是，双糖和多糖不一定是还还原糖，原糖，其中乳糖和麦芽糖是其中乳糖和麦芽糖是还还原糖，蔗糖和淀粉是原糖，蔗糖和淀粉是非非还还原糖。原糖。2.粘度法粘度法 原理：酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物，使原理：酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物，使粘度下降，通过粘度计测定流速改变来计算酶粘度下降，通过粘度计测定流速改变来计算酶活力。该法灵敏度较高，可形象反映外切酶在活力。该法灵敏度较高，可形象反映外切酶在动物体内的作用方式，较适宜于饲用酶活性的动物体内的作用方式，较适宜于饲用酶活性的测定。测定。特点：特点：重复性差重复性差 ，费时、操作复杂、单位难以费时、操作复杂、单位难以换算成国际单位换算成国际单位 。3.琼脂平板扩散法琼脂平板扩散法 原理：将原理：将NSPS NSPS 底物与琼脂混融制成琼脂平板，底物与琼脂混融制成琼脂平板，将酶样点于琼脂板上的小孔中，培养一定时间，将酶样点于琼脂板上的小孔中，培养一定时间，选用能与底物发生显色反应的显色剂染色，显选用能与底物发生显色反应的显色剂染色，显示出染色背景区和无色透明的水解区，水解区示出染色背景区和无色透明的水解区，水解区直径与酶量的对数呈正相关，由水解区直径计直径与酶量的对数呈正相关，由水解区直径计算酶活力。算酶活力。特点：灵敏度高，是还原糖法的特点：灵敏度高，是还原糖法的100100倍，测定所需样品倍，测定所需样品量微，无需特殊设备。量微，无需特殊设备。4.可溶性的染色底物可溶性的染色底物 原理：人工合成的含色原基团的底物在酶的作原理：人工合成的含色原基团的底物在酶的作用下释放出有色物质，利用分光光度计比色测用下释放出有色物质，利用分光光度计比色测定有色物质含量，计算酶活力。定有色物质含量，计算酶活力。特点：特点：重复性好，操作简便，灵敏度较高重复性好，操作简便，灵敏度较高 ，但，但合成底合成底物与天然底物有区别，对结果的准确性可能有影响物与天然底物有区别，对结果的准确性可能有影响 ，并且底物昂贵。并且底物昂贵。D.脂肪酶脂肪酶 原理：脂肪酶在一定条件下原理：脂肪酶在一定条件下 ，能使甘油三酯，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油，所释放的水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油，所释放的脂肪酸，可用标准碱溶液进行中和滴定，用脂肪酸，可用标准碱溶液进行中和滴定，用pHpH或酚酞指示反应终点，根据消耗的碱量，或酚酞指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活计算其酶活。反应式为：反应式为：RCOOH+NaOH RCOOH+NaOH RCOONa+H2O RCOONa+H2OE.植酸酶植酸酶 1.国标法（钒国标法（钒钼酸铵法）钼酸铵法）原理：利用植酸酶水解植酸钠产生无机磷，再原理：利用植酸酶水解植酸钠产生无机磷，再加入酸性钼钒试剂终止反应，同时与无机磷反应加入酸性钼钒试剂终止反应，同时与无机磷反应生成黄色钒钼磷络和物，在生成黄色钒钼磷络和物，在415415nmnm比色测定含比色测定含磷量，再以标准植酸酶为参照物，间接计算被测磷量，再以标准植酸酶为参照物，间接计算被测样品中植酸酶的含量。样品中植酸酶的含量。E.植酸酶植酸酶 2.硫酸亚铁硫酸亚铁钼蓝法钼蓝法 原理：原理：利用植酸酶可以水解植酸酶释放无机磷利用植酸酶可以水解植酸酶释放无机磷的原理，通过加入盐酸使水解反应停止，然后的原理，通过加入盐酸使水解反应停止，然后加入钼酸铵及加入钼酸铵及FeSOFeSO4 47H7H2 2O O的混合液使溶液显色，的混合液使溶液显色，在在720720nmnm波长下测定其吸收值，以标准酶为参照波长下测定其吸收值，以标准酶为参照物，间接计算被测样品中植酸酶的含量。物，间接计算被测样品中植酸酶的含量。E.植酸酶植酸酶 3.3.丙酮丙酮磷钼酸铵法磷钼酸铵法 原理：磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合原理：磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后，可慢慢生成黄色磷钼酸铵，加入丙酮后使黄后，可慢慢生成黄色磷钼酸铵，加入丙酮后使黄色物质提出来，在色物质提出来，在355355nmnm波长处测吸光度，灵敏波长处测吸光度，灵敏度增加度增加1010倍。倍。特点：特点：钒钒钼酸铵法灵敏度最高，丙酮法稳定性最好，钼酸铵法灵敏度最高，丙酮法稳定性最好，抗干扰能力较强。抗干扰能力较强。E.植酸酶植酸酶 4.4.VCVC钼蓝法钼蓝法 原理：该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放原理：该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理，通过加入三氯乙酸使反应停止，无机磷的原理，通过加入三氯乙酸使反应停止，然后加人钼酸铵与然后加人钼酸铵与VCVC的混合液，使溶液显色，在的混合液，使溶液显色，在820820nmnm波长下测定吸光度，再以标准磷溶液的吸波长下测定吸光度，再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归方程，最后以待测样品吸光度代人方程，计算出方程，最后以待测样品吸光度代人方程，计算出酶活性。酶活性。影响酶活力的主要因素影响酶活力的主要因素A.底物种类和浓度B.酶活力单位定义C.酶反应pH值D.酶反应温度E.酶反应时间A.A.底物种类和浓度底物种类和浓度 同种方法采用不同底物测定，结果相差很大。同种方法采用不同底物测定，结果相差很大。例如木聚糖酶的检测，燕麦木聚糖与桦木木聚例如木聚糖酶的检测，燕麦木聚糖与桦木木聚糖的测定结果就有明显差距。糖的测定结果就有明显差距。底物浓度对酶反应速度的影响图底物浓度对酶反应速度的影响图B.酶活力单位定义酶活力单位定义 国际酶学会标准单位：国际酶学会标准单位：在特定条件下，在特定条件下，在特定条件下，在特定条件下，1 1分钟分钟分钟分钟内能转内能转内能转内能转化化化化1 1umolumol底物的酶量，称一个国际单位（底物的酶量，称一个国际单位（底物的酶量，称一个国际单位（底物的酶量，称一个国际单位（IUIU）。）。）。）。酶活计算公式：酶活计算公式：酶活性酶活性 (U/g)=(U/g)=A A D D 1000 1000 0.2 0.2 1010 150.13 150.13 WW其中其中:A A 比色测定的木糖量，比色测定的木糖量，mg/mlmg/ml；D D 稀释倍数；稀释倍数；1000 1000 当量换算因数，当量换算因数，mmol-umolmmol-umol ；W W 酶样品重量，酶样品重量，g g；150.13 150.13 木糖的分子量，木糖的分子量，mg/mmolmg/mmol；10 10 反应时间，分钟。反应时间，分钟。B.酶活力单位定义酶活力单位定义 木聚糖酶的活性定义木聚糖酶的活性定义A A：在测定条件下，：在测定条件下，1 1秒钟秒钟秒钟秒钟从燕麦木从燕麦木聚糖中产生聚糖中产生1nmol1nmol木糖所需的酶量。木糖所需的酶量。酶活计算公式：酶活计算公式：酶活（酶活（IUIU）=A D 1,000,000 A D 1,000,000 0.2 600 150.13 W 0.2 600 150.13 W 其中其中:A A 比色测定的木糖量，比色测定的木糖量，mg/mlmg/ml；D D 稀释倍数；稀释倍数；1,000,000 1,000,000 当量换算因数，当量换算因数，mmol-nmolmmol-nmol；W W 酶样品重量，酶样品重量，g g；150.13-150.13-木糖的分子量，木糖的分子量，mg/mmolmg/mmol。600 600 反应时间，秒。反应时间，秒。C.酶反应酶反应pH值值 pH pH影响酶活力的因素影响酶活力的因素:影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响的解离状态，最终影响ESES形成。形成。影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。影响酶与底物的结合，极度影响酶与底物的结合，极度影响酶与底物的结合，极度影响酶与底物的结合，极度pHpHpHpH的条件引起酶蛋白的条件引起酶蛋白的条件引起酶蛋白的条件引起酶蛋白的变性。的变性的变性。的变性。C.酶反应酶反应pH值值最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。最适pH一般接近在48 之间.D.酶反应温度酶反应温度 温度对酶促反应速度的影响有两个方面：温度对酶促反应速度的影响有两个方面：提高温度，加快反应速度。提高温度，加快反应速度。提高温度，酶变性失活。提高温度，酶变性失活。这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。素为主。最适温度就是这两种因素综合作用的最适温度就是这两种因素综合作用的结果。结果。D.酶反应温度酶反应温度E.酶反应时间酶反应时间 酶反应方程式：随着生成物浓度的增加，酶反应速度减慢，当随着生成物浓度的增加，酶反应速度减慢，当生成物达到某一浓度，酶反应即停止。生成物达到某一浓度，酶反应即停止。E.酶反应时间酶反应时间 从图中可以看到，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，由于底物浓度降低，产物反馈抑制，逆反应速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反应速度逐渐下降，最后完全停止。E.酶反应时间酶反应时间 在测定酶促反应速度时，要避免以上干扰因素，在测定酶促反应速度时，要避免以上干扰因素，必须在酶促反应初期进行，在最初这段时间内必须在酶促反应初期进行，在最初这段时间内的反应速度称之为反应初速度，在过量的底物的反应速度称之为反应初速度，在过量的底物存在下，反应初速度与酶浓度成正比。存在下，反应初速度与酶浓度成正比。F.激活剂、抑制剂激活剂、抑制剂 凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。激活剂作用包括两种情况：激活剂作用包括两种情况：一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。简单有机化合物。另一种是激活酶原，无活性另一种是激活酶原，无活性有活性，这一类激有活性，这一类激活剂可能是离子或蛋白质。活剂可能是离子或蛋白质。G举例举例 2 2种木聚糖酶测定方法的比较种木聚糖酶测定方法的比较测定条件测定条件 方法1 方法方法2 温度温度 55 50 pH 5.3 5.5缓冲液缓冲液 0.05M醋酸钠缓冲液 0.1M 醋酸钠缓冲液 反应时间反应时间 10min 30min 底物底物浓浓度度 1木聚糖 1.2%木聚糖 加酶量加酶量 0.2ml 1ml 底物量底物量 1.8ml 1ml 反应终止液反应终止液 DNS 2ml DNS 3ml 显色时间显色时间 10min 10min 加水量加水量 10ml G.举例举例木聚糖酶测定结果标识值(U/g)方法1(U/g)方法2(U/g)样本129,00025,868 11,189 样本250,00039,918 30,583 THE ENDTHANK YOU!