蛋白质免疫印迹实验.pptx

蛋白质免疫印迹实验蛋白质免疫印迹实验蛋白质免疫印迹实验第1页一一 试验原理试验原理 n Western Blotting 是用来检测蛋白质一个技术。n首先将含有待测蛋白蛋白质混合物进行凝胶电泳分离，然后将已经分离蛋白质经过电泳技术从凝胶转移到固体支持物上，这一固体支持物当前常为硝酸纤维素薄膜。随即以待测蛋白质上抗原决定簇特异性抗体（称为第一抗体）为探针，与固体支持物上蛋白质进行免疫反应，最终用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶抗第一抗体抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应，只有与第一抗体特异性结合待测蛋白才能与第二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶底物用显色剂存在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体待测蛋白，经过颜色反应即能显现出来。蛋白质免疫印迹实验第2页一一 试验原理试验原理 n电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是经过电转移仪器完成。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二者结合在一起，然后将外面二侧用Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治”结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。蛋白质免疫印迹实验第3页一一 试验原理试验原理 其定量关系符合以下公式：nVe=Vo+KV1nVe：某一溶质洗脱体积nVo：层析柱外水体积nVi：层析柱内水体积nK：某一溶质分配系数蛋白质免疫印迹实验第4页1试剂电转移缓冲液 pH8.3n39mM甘氨酸n4.8mM Tris碱n0.037%SDSn20%甲醇n混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇，定容到1000ml.封闭缓冲液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于PBS中二试剂和器材二试剂和器材蛋白质免疫印迹实验第5页1试剂nPBS:NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到1000ml,分装后，15磅20分钟灭菌。n4-氯萘酚显色液：用30mg 4-氯萘酚（简称4-CN）溶于1ml无水乙醇中制成母液。将5014-CN对母液和5130%H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。n 氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰乙酸n氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水二试剂和器材二试剂和器材蛋白质免疫印迹实验第6页 2器材n电转移仪器n恒温摇床n硝酸纤维素薄膜nWhatman 3MM滤纸n电泳仪 裁纸刀 n25cm培养皿 玻璃棒二试剂和器材二试剂和器材蛋白质免疫印迹实验第7页n1蛋白质电转移n戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶一样大硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角剪去一角作为标识。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水表面，使水从膜下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿滤纸放在阳极上，在滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间气泡，再将浸湿硝酸纤维素薄膜小心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随即将12%SDS-PAGE凝胶舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最终加上石墨电极板，接通电源进行电转移，电流大小由凝胶大小决定，为0.65mA/平方厘米。电转移2小时后，停顿通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。三三 操作步骤操作步骤 蛋白质免疫印迹实验第8页n2显色反应n首先进行分子量标识氨基黑染色。切下转有分子量标识硝酸纤维素薄膜，用含有0.3%吐温20PBS缓冲液漂洗三次后（每次15分钟），再将其浸入氨基黑染液中，室温染色5分钟，然后置于氨基黑脱色液中脱去背景，水中漂洗后景干备用。三三 操作步骤操作步骤 蛋白质免疫印迹实验第9页n转有样品硝酸纤维素薄膜用含有5%脱脂牛奶PBS缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST第一抗体，平缓摇动，室温保温1小时。然后用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次 30分钟。将辣根过氧分物酶标识羊抗兔免疫球蛋白第二抗 体用封闭液稀释50倍后，加入吐温20至终浓度为0.05%，然后与上述漂洗硝酸纤维素薄膜进行反应，将膜浸于其中，平放在平缓摇动摇床平台上，室温温育 1小时后，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次5分钟，再加入4-氯萘酚显色液，加入 51 30%H2O2，将硝酸纤维素薄膜置于其中迟缓摇动，待所检测蛋白带显色到达最深程度后，将硝酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停顿显色反应。取出硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保留结果。三三 操作步骤操作步骤 蛋白质免疫印迹实验第10页n1.为何裁剪滤纸必须与凝胶大小完全一致？若不是这么结果会怎样？n2.电转移时为何都必须带手套小心操作并除去气泡，不然结果会怎样？n在进色后应时应注意哪些问题？n请简述免疫印迹试验原理，并将之与免疫学相关概念联络起来。四四 思索题思索题蛋白质免疫印迹实验第11页