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第十四章第十四章 全自动全自动DNADNA测序仪和测序仪和 蛋白质自动测序仪蛋白质自动测序仪元素周期表的发现奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础元素周期表“基因组序列图”将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础！“基因组”-生命科学的“元素周期表”人体解剖图奠定了现代医学发展的基础生命的奥秘蕴藏于“四字天书”之中GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCTv了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病，是生命科学的核心内容之一v核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子，其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主要对象v核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结构核苷酸的线性排列构成它的一级结构v蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的一级结构是了解蛋白质功能的基础第一节 全自动DNA测序仪DNA测序核苷酸序列v早期：小片段重叠法通过测定RNA序列来推测DNA序列缺点：既费时又不准确v20世纪80年代以后：DNA自动测序仪Sanger双脱氧链末端终止法Maxam-Gilber化学降解法优点：操作简单、安全、快速、准确 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 v都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得DNA序列 v双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动DNA测序仪中应用广泛 原理一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。因此生成4种放射性标记的分子从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。Maxam-Gilber化学降解法 基本步骤第一步，对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰；第二步，修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5和3的磷酸二酯键断裂；第三步，比较G、A+G、C+T、C以及AC各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读取DNA序列。特点重现性好，所用试剂简单，易于掌握；所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果较好；序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝；可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结构及蛋白质-DNA相互作用。无需延伸反应及克隆更适于含有稀有碱基或GC含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并测序。比较繁琐费时，过长序列有困难。121314（一）双脱氧链末端终止法测序原理 v利用DNA的体外合成过程聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）vDNA聚合酶的催化v以目的DNA为模板v按照碱基互补配对原则v在引物的引导下单核苷酸聚合形成新单核苷酸聚合形成新单核苷酸聚合形成新单核苷酸聚合形成新DNADNA链链链链普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为 4种2-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）dNTP结构示意图结构示意图测序反应体系中，加入的核苷酸单体为 2,3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）ddNTP结构示意图结构示意图PCRPCR（聚合（聚合（聚合（聚合酶链酶链式反式反式反式反应应）原理）原理）原理）原理反反应所需物所需物质：DNA模板、引物、模板、引物、DNA聚合聚合酶、dNTP、缓冲液冲液每个循每个循环包括：包括：变性（性（90）、退火（）、退火（54）、延伸（）、延伸（72）与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。ATemplatePrimerdNTPsPolymeraseTerminatorGCT双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）TCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGA TTT双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）T双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）ACG双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）双脱氧链末端终止法测序反应原理（5）（二）新生链的荧光标记原理v早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害、背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代v荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在DNA自动测序中得到广泛应用荧荧光染料光染料 标记标记法法单色单色荧光标记法荧光标记法多色多色荧光标记法荧光标记法荧光标记荧光标记引物法引物法荧光标记荧光标记终止底物法终止底物法荧光标记荧光标记引物法引物法荧光标记荧光标记终止底物法终止底物法多色荧光标记法-荧光标记引物法v定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5端v一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同v测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等按A、T、C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、C、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内电泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系荧光标记引物法荧光标记引物法图图18-8荧光标记引物法原理荧光标记引物法原理多色荧光标记法-荧光标记终止底物法v定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上v反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料v经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息模板：模板：TCCATGAT产物：物：AAGAGGAGGTAGGTAAGGTACAGGTACTAGCTGGTTAAC新生链的荧光标记原理都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一对应关系荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同一管中完成荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点：单色荧光标记法也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同一扩增管中进行，电泳时在同一泳道中电泳单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点：（三）荧光标记DNA的检测原理v测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大多数产物均为单链v反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳v两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口v由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段vDNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光v代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理v整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合v经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来多色荧光标记技术检测优点：v一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，提高了测序精度v一个样品所有反应产物只需进样一次，所以一次实验便可以处理较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下，加样的工作量也大大减少DNA序列测定的策略n克隆亚克隆的方法(clone-by-clone)n全基因组散弹法(鸟枪法)(whole-genomeshotgunmethod)两种大规模基因组测序策略的比较两种大规模基因组测序策略的比较项项项项 目目目目 策策策策 略略略略全基因全基因全基因全基因组组组组霰霰霰霰弹弹弹弹法法法法逐步克隆法逐步克隆法逐步克隆法逐步克隆法 遗传遗传遗传遗传背景背景背景背景不需要不需要不需要不需要需要（需构建精确的需要（需构建精确的需要（需构建精确的需要（需构建精确的物理物理物理物理图谱图谱图谱图谱）速度速度速度速度快快快快慢慢慢慢费费费费用用用用低低低低高高高高计计计计算机性能算机性能算机性能算机性能高（以全基因高（以全基因高（以全基因高（以全基因组为单组为单组为单组为单位位位位进进进进行拼接）行拼接）行拼接）行拼接）低（以低（以低（以低（以BACBAC为单为单为单为单位位位位进进进进行拼接）行拼接）行拼接）行拼接）适用范适用范适用范适用范围围围围工作框架工作框架工作框架工作框架图图图图精精精精细图细图细图细图代表代表代表代表测测测测序物种序物种序物种序物种果果果果蝇蝇蝇蝇、水稻、水稻、水稻、水稻人、人、人、人、线线线线虫虫虫虫克隆亚克隆的方法(clone-by-clone)是以物理图谱为基础、以大插入片断克隆为单位的定向测序策略。其方法是先构建议染色体为单位的遗传图谱，再利用高覆盖率的大片断基因组文库（BAC、YAC等）获得精细的物理图谱，选择合适的BAC或YAC克隆进行亚克隆测序，用计算机拼装，通过引物步移等手段填补BAC内的空洞，形成一条完整的BAC序列。然后参照物理图谱，将相互关联、部分重叠的BAC克隆联成一个大的重叠群(Contig)。但一些长串联的高度重复序列区域和克隆或测序所不能获得的区域，仍会存在一些物理空洞（PhysicalGap）。与Shot-gun方法相比较，ClonebyClone的技术难度较高，尤其是大片段基因组文库（如BAC文库）的精细物理图谱的构建是技术性极强的工作；并且测序费用和所需的时间也相对较多。人类基因组计划研究的主要成果和人类基因组计划研究的主要成果和进展表现在这进展表现在这“四张图四张图”遗传图谱遗传图谱 又称为连锁图谱（又称为连锁图谱（linkage maplinkage map），），指基因或指基因或DNADNA标志在染色体上的相对标志在染色体上的相对位置与遗传距离位置与遗传距离物理图谱物理图谱 以定位的以定位的DNADNA标记序列如标记序列如STSSTS作为路作为路标，以标，以DNADNA实际长度即实际长度即bp、kb、Mb为图距的基因组图谱。为图距的基因组图谱。转录图谱转录图谱 利用利用EST（expressedsequencetags 表达序列标签）作为标记所构表达序列标签）作为标记所构建的分子遗传图谱建的分子遗传图谱序列图谱序列图谱 通过基因组测序得到的，以通过基因组测序得到的，以A A、T T、G G、C C为标记单位的基因组为标记单位的基因组DNADNA序列序列1 1物理图谱的构建2 2大片段克隆的筛选3 3霰弹法测序与“工作框架图”的构建4 4序列的全组装与“完成图”构建全基因组散弹法(鸟枪法)(whole-genome shotgun method)是借助物理和化学的手段，将整个基因随机打断成一定大小的片段进行测序，再根据序列间的重叠关系进行计算机拼接和组装，确定它们在基因组中的位置。Shot-gun的优点是速度快、简单易行、成本较低，可在短时间内通过集中设备和人力获得海量的基因组序列。缺点在于序列的拼接组装比较困难，在重复序列较多的区域难度更大；由于缺少基因组的物理图谱，有些序列难以准确定位，成为游离片段；此外，受文库的随机性和测序的覆盖度的影响，某些区域会形成较大的空洞（Gap）二、全自动DNA测序仪的结构与功能全自动DNA测序仪v平平板型电泳板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳v毛细管电泳技术毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中（内径50m100m），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离平板型电泳毛细管电泳 310型全自动遗传分析仪型全自动遗传分析仪ABIPrism3100遗传分析仪遗传分析仪3700型全自动遗传分析仪型全自动遗传分析仪安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE500/1000/4000（一）仪器的组成v主机：主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统；大致可分为自动进样器区自动进样器区、凝胶块、凝胶块区区和检测区检测区等结构功能区v微型计算机v各种应用软件PE310基因分析仪的结构基因分析仪的结构凝胶块区 自动进样器区 检测区 PE310基因分析仪的主机分区基因分析仪的主机分区热板热板毛细管毛细管雷射检测器雷射检测器注射器驱动杆注射器驱动杆毛细管和电极毛细管和电极注射器注射器正极缓冲液正极缓冲液泵块泵块自动进样器自动进样器负极缓冲液负极缓冲液PE310基因分析仪的基本结构基因分析仪的基本结构（二）仪器各组成部分的功能1.主机功能具有自动灌胶、进样、电泳、荧光检测等功能(1)自动进样器区功能自动进样器受程序控制进行三维移动，因负极电极和毛细管均固定不动，故许多操作如毛细管进入样品盘标本孔中进样、电极和毛细管在电极缓冲液瓶、洗涤液和废液管中移动等均依靠自动进样器的移动完成；电极为电泳的负性电极，测序过程中，正、负极之间的电势差可达15000伏，如此高的电势差可促进DNA分子在毛细管中很快泳动，达到快速分离不同长度DNA片段的目的；样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。(2)凝胶块区功能 注射器注射器驱动驱动杆杆：给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中。在分析每一个样品前，泵自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶；样样品品盘盘按按钮钮：控制自动进样器进出；注射器注射器固定平台固定平台：起固定注射器的作用；电电极极：为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液中；正极正极缓冲液阀缓冲液阀：当注射器驱动杆下移，将注射器内的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进入缓冲液；电泳时此阀打开，提供电流通道；玻璃玻璃注射器注射器：储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力；毛细管毛细管固定螺母固定螺母：固定毛细管；废液废液阀阀：在清洗泵块时控制废液流。(3)检测区功能激光检测器窗口及窗盖激光检测器窗口及窗盖：激光激光检测器窗口检测器窗口正对毛细管检测窗口，从仪器内部的氩离子激光器发出的激光可通过激光检测器窗口照到毛细管检测窗口上。电泳时，当荧光标记DNA链上的荧光基团通过毛细管窗口时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，荧光经分光光栅分光后投射到CCD摄像机上同步成像。窗窗盖盖起固定毛细管的作用，同时可防止激光外泄；激光检测器检测特征性的荧光光谱激光检测器检测特征性的荧光光谱CGTACGCATGA激光检测器检测特征性的荧光光谱激光检测器检测特征性的荧光光谱加加热热板板：电泳过程中起加热毛细管的作用，一般维持在50；毛毛细细管管：为填充有凝胶高分子聚合物的玻璃管，直径为50m，电泳时样品在毛细管内从负极向正极泳动；热热敏敏胶胶带带：将毛细管固定在加热板上。DNA测序图2.微型计算机功能微型计算机功能控制主机的运行，并对来自主机的数据进行收集和分析。设置测序条件（样品的进样量、电泳的温度、时间、电压等），同步监测电泳情况并进行数据分析3.各类软件功能各类软件功能承担数据收集、DNA序列分析及DNA片段大小和定量分析等功能。其结果可由彩色打印机输出三、全自动DNA测序仪的常见 故障及维护 毛细管电泳型DNA测序仪 平板电泳型DNA测序仪电泳时仪器显示无电流电极弯曲电泳时产生电弧其它电泳时仪器显示无电流传热板粘住胶板其它（一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护电泳时仪器显示无电流v电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管v电极弯曲而无法浸入缓冲液中v毛细管未浸入缓冲液中v毛细管内有气泡等电极弯曲v安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令，电极不能准确插入各管中v运行前未将样品盘归位、或虽然执行了归位操作，但X/Y轴归位尚未结束就运行Z轴归位等电泳时产生电弧v主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积其它v测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝胶干燥而阻塞毛细管v定期清洗泵块v定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管（二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护电泳时仪器显示无电流v电泳缓冲液配制不正确v电极导线未接好或损坏v正极或负极铂金丝断裂v正极或负极的胶面未浸入缓冲液中传热板粘住胶板v主要原因为上方的缓冲液室漏液其它v倒胶前应按照操作要求认真清洗玻璃板v配制凝胶时应注意胶的浓度、TEMED含量、尿素浓度等v倒胶时需注意不能有气泡v将待测样品加入各孔前，应使用缓冲液冲洗各孔，把尿素冲去，以免影响电泳效果vSmith等于1986年首次建立了一种使用四种不同荧光分别标记四种不同碱基的方法v同年，Ansorge建立了一种使用单色荧光四甲基罗丹明作为标记染料的自动测序方法v平板法电泳是经典的电泳技术，具有样品判读序列长（600bp900bp）、一块凝胶板上可同时进行多个样品测序（可达96个）的优点v毛细管电泳为近20年来建立的一种快速、高效、进样量少、灵敏度高的新技术，可测序列达到750bp左右四、全自动DNA测序仪的进展单色荧光标记单色荧光标记四色荧光标记四色荧光标记平板型电泳平板型电泳毛细管电泳毛细管电泳v芯片实验室（芯片实验室（lab-on-a-chip）v缩微生物处理器（缩微生物处理器（microfabricatedbioprocessor），成功完成纳升级标），成功完成纳升级标本的本的SangerDNA测序测序缩微生物处理器结构示意图2006年，美国科学院院报（PANS）上公布了Blazej等建立的缩微生物处理器测序技术。缩微生物处理器基本结构为3层玻璃薄片和一层聚二甲基硅氧烷薄片，各层间紧密粘合形成圆盘状，直径仅10厘米。聚二甲基硅氧烷是一种新型材料，具有能调控水合作用、通透性好等特点，保证了缩微生物处理器能够准确进行反应。该材料最近在蛋白结晶结构分析中也发挥了重要作用。五、全自动DNA测序仪的主要应用v人类基因组测序v人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断v法医的亲子鉴定和个体识别v生物工程药物的筛选v动植物杂交育种第二节 蛋白质自动测序仪v蛋白质顺序指肽链中氨基酸的排列顺序v通常从左至右表示肽链从氨基酸氨基端（N末端）到羧基端（C末端）v蛋白质测序仪工作原理：执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程一、蛋白质测序仪的工作原理 Edman降解法降解法多肽链多肽链N末端末端NH2PITC弱碱弱碱苯异硫甲氨酰肽苯异硫甲氨酰肽TFA噻唑啉酮苯胺（噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物）衍生物剩余多肽剩余多肽弱弱碱碱苯异硫甲氨酰肽苯异硫甲氨酰肽TFA噻唑啉酮苯胺（噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物）衍生物剩余多肽剩余多肽PTH氨基酸氨基酸PTH氨基酸氨基酸HPLCHPLC苯异硫氰酸酯三氟乙酸经酸作用，再进一步环化苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物上述降解循环的偶联和环化发生在测序仪的反应器（筒）中，转化则在转化器进行。转化后的PTH氨基酸经自动进样器注入高效液相色谱(highperformanceliquidchromatogram,HPLC)进行在线检测。根据PTH氨基酸的洗涤滞流时间确定每一种氨基酸。二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能v测序反应系统主要部件为反应器v氨基酸分析系统由高效液相色谱毛细管层析柱组成v信息软件处理系统根据氨基酸的层析峰来判断为何种氨基酸三、蛋白质测序仪的主要应用v新蛋白质的鉴定在凝胶电泳中出现的未知条带可以利用蛋白质测序仪来测定其序列v分子克隆探针的设计用蛋白质序列信息设计PCR引物和寡核苷酸探针。可以利用这些探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选v抗原的人工多肽合成本本章章小小结vDNA测序仪是检测核酸一级结构-核苷酸线性排列顺序的自动化仪器v工作原理包括Sanger双脱氧链末端终止法或Maxam-Gilbert化学降解法v在单纯以测定DNA序列为目的的全自动DNA测序仪中以双脱氧链末端终止法应用较广泛本本章章小小结其原理是利用DNA的体外合成过程，但与普通PCR不同的是，双脱氧链末端终止法测序反应中除有-脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入2-双脱氧核苷三磷酸（2-ddNTP），由于没有-OH，不能进行后续反应，使正在延伸的DNA链在此终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段，通过电泳分离后可读出新生DNA链的序列本本章章小小结v用荧光标记新生链时，分为多色标记法和单色标记法v根据标记部位不同，又分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法v荧光标记引物法的荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且两者在时间上有一定间隔v荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成v采用四色荧光标记进行测序反应时，一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，提高了测序精度本本章章小小结v全自动DNA测序仪根据电泳方式的不同分为平板型电泳和毛细管电泳两种仪器类型v测序仪主要由主机、微型计算机和各种应用软件等组成，主机包括自动进样器区、凝胶块区和检测区等结构功能区本本章章小小结v毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障包括电泳时仪器显示无电流、电极弯曲、电泳时产生电弧等v平板电泳型DNA测序仪的常见故障包括电泳时仪器显示无电流、传热板粘住胶板等，应根据具体情况及时处理本本章章小小结v蛋白质测序仪是检测蛋白质一级结构氨基酸排列顺序的自动化仪器v目前的蛋白质测序仪实际上是执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程本本章章小小结v蛋白质测序仪包括测序反应系统、分析系统和数椐处理系统v主要应用于新蛋白质的鉴定、分子克隆探针的设计和抗原的人工多肽合成等方面