Western-blot-、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用-(最终版).ppt

Western blot、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用湘雅医学院精神医学1301班2CONTENTS蛋白质蛋白质双向双向电电泳的原理泳的原理应用应用蛋白质蛋白质双向电双向电泳的方泳的方法法234Western blot原理原理及及方法方法13Western blot原理及方法蛋白质印迹法14Western blotting19751979同年最终Edward M.SouthernEdward M.Southern建立建立了将了将DNADNA转移到硝酸纤维转移到硝酸纤维素膜素膜 （NCNC膜）上，并利膜）上，并利用用DNADNARNARNA杂交检测特定杂交检测特定的的DNADNA片段的方法片段的方法McMasterMcMaster和和CarmichaelCarmichael对对RNARNA进行印迹分析，发进行印迹分析，发明明 NorthernNorthern印迹技术印迹技术 George StarkGeorge Stark对电泳对电泳后的蛋白质分子进行后的蛋白质分子进行印迹分析从而发明印迹分析从而发明westernwestern印迹技术印迹技术 Western blotting！5 什么是蛋白蛋白质质印迹法印迹法？Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定的方法。6 为什么要作蛋白什么要作蛋白质印迹印迹实验？2不同的样品中检查蛋白质的表达情况，上调或下调表达，如疾病和正常的样品之间的表达差异性1研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western Blot的基本原理的基本原理 蛋白蛋白样品的制品的制备SDS聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳转膜膜封封闭一抗孵育一抗孵育二抗孵育二抗孵育底物底物显色色 Western Blotting 操作流程操作流程9 第一步转 膜 第三步一抗杂交 第五步底物显色 第四步二抗杂交 第二步封 闭 Western Blotting 操作流程操作流程n n优点优点：n n1.1.快速（一种抗体）快速（一种抗体）n n2.2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条没有二抗交叉反应引起的非特异性条带带n n缺点缺点：n n1.1.免疫反应性降低免疫反应性降低n n2.2.无信号二级放大无信号二级放大n n3.3.抗体标记费时昂贵抗体标记费时昂贵,使用不方便使用不方便 WesternBlottingWesternBlotting方法一方法一:直接法直接法n n优点优点：n n1.1.免疫特异性不受标记影响免疫特异性不受标记影响n n2.2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）n n3.3.多种标记的二抗可供选择多种标记的二抗可供选择n n4.4.可选择不同的可选择不同的MarkerMarkern n缺点缺点：n n1.1.交叉反应引起的非特异性条带交叉反应引起的非特异性条带n n2.2.额外的二抗孵育以及条件优化额外的二抗孵育以及条件优化 WesternBlottingWesternBlotting方法二方法二:间接法接法n n直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所为一抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所以一般情况下都采用间接法进行检测以一般情况下都采用间接法进行检测 为什么一般情况下都采用间接法进行检测？WesternBlottingWesternBlotting间接法操作流程接法操作流程分子量标准显色结果抗体膜的选择 WesternBlottingWesternBlotting设计标准准15 不可小看不可小看“蛋白蛋白标准准”-”-分子量分子量标准的准的选择分子量标准预混分子预混分子量标准量标准修饰分子修饰分子量标准量标准预染分子预染分子量标准量标准n n预混分子量标准预混分子量标准高分子量高分子量标标准准低分子量低分子量标标准准宽宽分子量分子量标标准准n n预染分子量标准预染分子量标准单单色色预预染染多色多色预预染染n n修饰分子量标准修饰分子量标准 糖基化糖基化 磷酸化磷酸化 荧荧光光标记标记 不可小看不可小看“蛋白蛋白标准准”-”-分子量分子量标准的准的选择n n高分子量标准n n低分子量标准n n宽分子量标准 预混分子量混分子量标准准n n单色预染n n多色预染 预染分子量染分子量标准准n n糖基化n n磷酸化n n荧光标记 修修饰分子量分子量标准准价格便宜，价格便宜，简单快速封快速封闭与非特与非特异性抗体异性抗体结1.1.硝酸硝酸纤维素膜（素膜（NC膜）膜）灵敏度、分辨灵敏度、分辨率和蛋白率和蛋白亲和和力比常力比常规的膜的膜要高，要高，对蛋白蛋白的吸附能力要的吸附能力要远远大于大于NC膜膜2.PVDF2.PVDF膜膜对核酸和蛋白对核酸和蛋白质具有很强的质具有很强的结合能力结合能力，能，能代替代替NCNC膜用于膜用于分子印迹和杂分子印迹和杂交实验交实验。3.3.尼尼龙膜膜 膜膜 三种三种选择 选择标准选择标准1.1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）小）2.2.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）法，信噪比好）3.3.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜还要根据不同目的来挑选不同的转移膜 选择膜的标准 膜的特点n n作为作为westernwestern来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于用于用于用于westernwesternwesternwestern的抗体和的抗体和的抗体和的抗体和用于用于用于用于ELISAELISAELISAELISA的抗体，一般来说用于的抗体，一般来说用于的抗体，一般来说用于的抗体，一般来说用于westernwesternwesternwestern的抗体识别的是氨基酸序列的抗体识别的是氨基酸序列的抗体识别的是氨基酸序列的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于特异性；而可用于特异性；而可用于特异性；而可用于ELISAELISAELISAELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性序列特异性，有些是识别构像特异性序列特异性，有些是识别构像特异性序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确。所以一般根据抗体说明书来确定。定。n n做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带交叉反应条带交叉反应条带交叉反应条带。抗体的选择方便、便宜、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测化学显色法化学显色法灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短同位素法同位素法灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测化学发光法化学发光法Krypton Krypton 荧光底物荧光底物法荧光底物法显色的显色的方法方法玩转大学PPT素材 更多好素材请访问 http:/ 25蛋白质双向电泳的原理Enter your subtitle here226 双向电泳的实验原理第一向：等电聚焦第二向：SDSPAGE电泳第一向：等电聚焦n n聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)(Arc)和交联剂和交联剂N,N-N,N-甲叉丙甲叉丙烯酰胺烯酰胺(Bis)(Bis)在加速剂在加速剂N,N,NN,N,N四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）和催化剂硫酸铵（和催化剂硫酸铵（APAP）或核黄素的作用下聚合交联成三维）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为网状的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGEPAGE。第二向：第二向：SDSPAGESDSPAGE电泳泳3031蛋白质双向电泳的方法Enter your subtitle here332技术流程双向电泳(2DE/DIGE)实验组和对照组样品制备提出生物学问题凝胶图像分析差异蛋白点选取蛋白酶解及质谱分析差异蛋白点的成功鉴定生物学问题的解释n n目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术n n能实现多达能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析种不同蛋白质进行分离分析双向双向电泳泳(2DE/DIGE)等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离分子量大小通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离SDS-PAGE分离，使得蛋白质按分子量大小排序 双向电泳（2DE）示意图硝酸银染色图谱考马斯亮蓝染色图谱 2DE图谱将标记的样品混合双向电泳分离荧光扫描仪扫描图像重叠分析样品1：Cy3标记 双向电泳（DIGE）示意图 DIGE图谱n n双向电泳的最关键步骤之一双向电泳的最关键步骤之一n n制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质去除样品中核酸、盐离子等干扰物质 样品制备变性性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。增加增加样品溶解性的手段品溶解性的手段起起起起载载体作用的两性体作用的两性体作用的两性体作用的两性电电解解解解质质：即便在即便在变变性性剂剂和表面活性和表面活性剂剂存在的情况下，某些蛋白存在的情况下，某些蛋白质质也需要在也需要在盐盐离子的作用下离子的作用下才能保持其才能保持其处处于溶解状于溶解状态态，否，否则这则这些蛋白些蛋白质质在其在其处处于于PIPI点点时时会会发发生沉淀。生沉淀。Carrier ampholytesCarrier ampholytes的作用在于捕的作用在于捕获样获样品中的少量品中的少量盐盐分，从分，从而保而保证证蛋白蛋白质质的溶解性。的溶解性。应应用用时时，两性，两性电电解解质质的的浓浓度度应应小于小于0.20.2（w/v)w/v)。浓浓度度过过高会使高会使IEFIEF的速度降低。的速度降低。另外，另外，为为了保了保证实验证实验的精确性，在的精确性，在选择选择不同不同pHpH范范围围的的IPGIPG胶条胶条时时，也，也应应使两性使两性电电解解质质的的pHpH值值与之相符合。与之相符合。n n通过通过10000V10000V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦n n步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持n n聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、蛋白载样量、PHPH范围和胶条长度来确定。范围和胶条长度来确定。等等电聚焦聚焦理想显色剂的理想显色剂的理想显色剂的理想显色剂的7S7S7S7Sn n安全（safety）n n灵敏（sensitivity）n n简单（simplicity）n n特异性（specificity）n n快速（speed）n n稳定（stability）n n兼容性（synergy）蛋白蛋白检测n n硝酸银染色硝酸银染色 优点：灵敏度高，缺点：重复性差，质谱兼容性低n n考马斯亮兰染色：考马斯亮兰染色：优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低n n荧光染色：荧光染色：优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵n n其它染色方法：其它染色方法：胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等 蛋白蛋白检测n n常用软件：常用软件：常用软件：常用软件：Image-Master(Image-Master(Image-Master(Image-Master(GE HealthcareGE Healthcare)PDquest(PDquest(PDquest(PDquest(Bio-RadBio-Rad)n n分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析 图像分析像分析n n凝胶图像的扫描：凝胶图像的扫描：n n图像加工：图像加工：n n斑点检测和定量：斑点检测和定量：n n凝胶配比：凝胶配比：n n数据分析：数据分析：n n数据呈递和解释：数据呈递和解释：n n2-DE2-DE数据库的建立：数据库的建立：凝胶的凝胶的图像像处理分析和典型流程理分析和典型流程47 应用Western blot及及蛋白蛋白质质双向双向电电泳泳4aboutWesternBlotWesternBlot的医学的医学应用用Western blot法诊断囊虫病应用荧光定量PCR 和Western-blot 检测RNA干扰肺腺癌A549 细胞STAT3基因表达水平 Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原WesternBlotWesternBlot的三大医学的三大医学应用用1、Western blot法诊断囊虫病囊虫病是由猪带绦虫幼虫即囊尾蚴寄生于人体引起的囊虫病是由猪带绦虫幼虫即囊尾蚴寄生于人体引起的人兽共患寄生虫病。人兽共患寄生虫病。n n免疫学试验对本病诊断有重要作用，但目前用各种方法纯化的抗原其敏感性、特异性均不理想。n n运用DN A重组技术,构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库,以囊虫病患者血清及病猪血清为抗体,从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）,这些抗原克隆经IPTG诱导,形成-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白(fusion protein,FP)。n n采用简化采用简化Western blotWestern blot法法,以等比混和的四种融合蛋白为抗原检测囊虫病、华支睾吸虫病、包虫病患者血清中的相应抗体2 2、应用荧光定量、应用荧光定量PCR PCR 和和Western-blot Western-blot 检测检测RNARNA干干扰肺腺癌扰肺腺癌A549 A549 细胞细胞STAT3STAT3基因表达水平基因表达水平 n nWesternWestern印迹分析检测印迹分析检测STAT3STAT3表达表达n n荧光定量荧光定量PCR PCR 检测检测STAT3mRNA STAT3mRNA 的表达的表达凋亡相关蛋白的表达凋亡相关蛋白的表达 Western Blot 检测发现检测发现Western Blot 检测检测 SZL 作用作用 48 h 后凋亡相关后凋亡相关蛋白表达的变蛋白表达的变化化Bandleader 软件分析凋亡相关蛋白的相对表达率软件分析凋亡相关蛋白的相对表达率 Western Blot 检测结果的密度分析扫描直方图检测结果的密度分析扫描直方图(凋亡相关蛋凋亡相关蛋 白相对表达率白相对表达率=条带灰度值条带灰度值/actin 灰度值灰度值)3、Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原n n风疹病毒风疹病毒()能够引起先天感染。通过孕妇传播能够引起先天感染。通过孕妇传播,致使胎儿先天畸致使胎儿先天畸形或导致先天性风疹综合征如先天性心脏病、智力低下等。形或导致先天性风疹综合征如先天性心脏病、智力低下等。n n因此能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质因此能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质 、预防后天及、预防后天及再感染具有重要意义。再感染具有重要意义。n n目前临床上所用的目前临床上所用的ELISA ELISA 检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制抗原检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制抗原 ,特异度低、灵敏度差特异度低、灵敏度差,缺乏统一的抗原标准。缺乏统一的抗原标准。n n现可采用现可采用Western-blotWestern-blot的方法的方法,测定风疹病毒的主要抗原性蛋白测定风疹病毒的主要抗原性蛋白,以以指导临床应用指导临床应用 。双向电泳技术的应用04part030201计算机图像分析与大规模数据处理技术双向电泳技术(2-DE)质谱技术研究蛋白研究蛋白质组的三大核心技的三大核心技术:双向电泳技术(2-DE)在蛋白质组学中发挥着重要的作用,可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。作用1双向电泳技术在病原微生物蛋双向电泳技术在病原微生物蛋白质组研究中的进展白质组研究中的进展双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中发挥着重要作用，可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质问相互作用、蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。0102通过双向电泳技术分析对培养基和细胞内生长的细菌进行比较，发现感染巨噬细胞的军团菌、布鲁氏菌、沙门氏菌中分别有一些特殊蛋白被诱导或被阻遏。蛋白质组学双向电泳技术可作为致病微生物临床隔离群区分的可靠参数之一。在对流感嗜血杆菌研究中发现，实验室培养的和临床分离的遗传背景相同的菌株出现了新的ORF，对临床分离株NCTC8143进行双向电泳，发现色氨酸酶的含量较高，而实验室培养的菌株中则没有色氨酸酶。双向双向电泳技泳技术在病原微生物致病机理研究中的在病原微生物致病机理研究中的应用用n n双向电泳技术在病原微生物药物抗性基因功能研究中的应用n n双向电泳技术可以进行微生物抗性机理的研究。n nDiffes等对Divercin V4l抗性和野生型的产单核细胞 李斯特氏菌进行2-DE分析，发现至少在17个蛋白质存在差异，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9个蛋白质，而新增8个蛋白质，其中只有1个Rl是存在于已知该菌的数据库中，为鞭毛蛋白；机会致病真菌如念珠菌属产生了许多的耐药菌株。n n伊曲康唑类化合物通过抑制真菌细胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且对耐真菌药物的菌株起作用。Bruneau等对比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3种杀真菌药处理所产生的白色念珠菌双向电泳差异蛋白质图谱后认为，氟康唑和伊曲康唑在蛋白质组水平具有共同的作用机制。n n因此，病原微生物的耐药菌株和敏感菌株的双向电泳研究，对阐明耐药相关机制、鉴定新的药物靶位和耐药诊断标志有非常重要的价值。n n人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤差异蛋白质组分，在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供理论依据等方面都取得了一些重要的进展。肿瘤发生的理论依据等方面都取得了一些重要的进展。肿瘤发生的早期常常无任何症状，而只有在转移时才容易被发现，早期常常无任何症状，而只有在转移时才容易被发现，这往往导致延误了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期这往往导致延误了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期的标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重要的标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重要。2.2.双向双向电泳技泳技术在人在人类恶性性肿瘤研究中的瘤研究中的进展展n n双向电泳技术的出现，为动态、高通量的研究药物作用双向电泳技术的出现，为动态、高通量的研究药物作用机制提供了强有力的方法支持。机制提供了强有力的方法支持。n n双向电泳技术的另一应用就是研究药物的毒理作用。比双向电泳技术的另一应用就是研究药物的毒理作用。比较正常细胞与药物处理后细胞的蛋白质表达丰度变化，较正常细胞与药物处理后细胞的蛋白质表达丰度变化，可以提示药物的毒性作用机制。细胞在施药之后的代谢可以提示药物的毒性作用机制。细胞在施药之后的代谢反应做出实时的检测，不仅能确定疗效，也能针对毒性反应做出实时的检测，不仅能确定疗效，也能针对毒性代谢物质的发现而对药物进行直接的改良，是一项意义代谢物质的发现而对药物进行直接的改良，是一项意义深远的发现。深远的发现。3.3.双向双向电泳技泳技术在在药物作用机制研究的物作用机制研究的进展展63Thank you for listening