‘沙糖橘’S蛋白同源基因CrSPH的克隆与表达分析.pdf

西北植物学报,2 0 2 3,4 3(8):1 2 6 1-1 2 6 7A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.0 8.1 2 6 1 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 3-0 3-3 0;修改稿收到日期:2 0 2 3-0 5-2 6基金项目:国家外专局项目(QN 2 0 2 2 0 3 0 0 2 5 L);肇庆学院博士科研启动基金项目(6 1 1-6 1 2 2 8 1)作者简介:吴秀兰(1 9 7 8-),女,博士,副教授,主要从事柑橘遗传育种与分子生物学研究。E-m a i l:1 0 8 4 4 2 6 4q q.c o m*通信作者:唐文武,博士,教授,主要从事植物遗传育种与分子生物学研究。E-m a i l:w w t a n g z q u.e d u.c n 沙糖橘S蛋白同源基因C r S P H的克隆与表达分析吴秀兰1,唐文武2*,徐呈祥2,李桂花3(1 肇庆学院 食品与制药工程学院,广东肇庆 5 2 6 0 6 1;2 肇庆学院 生命科学学院,广东肇庆 5 2 6 0 6 1;3.广东省农业科学院蔬菜研究所,广州 5 1 0 6 4 0)摘 要:柑橘自交不亲和由S位点基因控制,前期S S H文库中筛选出1个自交不亲和相关的S蛋白同源基因(S-p r o t e i n h o m o l o g o u s g e n e,S PH),但其功能尚不明确。研究以 无籽沙糖橘 和 沙糖橘 为材料,利用反转录P C R技术克隆C r S PH基因,通过q P C R技术分析该基因表达特性,并进行原核表达和花粉萌发实验。结果表明,(1)C r S PH的C D S长度为4 1 7 b p,编码1 3 8个氨基酸,两材料间的C D S区存在3个碱基替换,引起2个氨基酸突变。(2)S o u t h e r n杂交实验表明,C r S PH基因在两材料基因组中均以单拷贝形式存在。(3)q P C R实验表明,C r S PH基因在 沙糖橘 花器官不同部位表达差异显著,子房中表达量最大,花瓣、花丝等组织中表达量均较低;在高表达的子房中,沙糖橘 表达量是 无籽沙糖橘 的1 6倍,表明C r S PH基因在 沙糖橘 中具有高度的组织表达特异性。(4)C r S PH基因在异交授粉第6,7天表达量最高,与其他时段差异均达到显著水平,第6天表达量是第1天表达量的1 2.4倍。(5)原核表达实验成功诱导出C r S P H蛋白,离体花粉萌发实验表明,随着异源 无籽沙糖橘C r S P H蛋白浓度的增加,无籽沙糖橘 萌发率受到显著的抑制。研究表明,C r S PH基因具有表达特异性,可能与柑橘自交不亲和有关。关键词:沙糖橘;C r S PH;表达分析;花粉萌发;自交不亲和中图分类号:Q 9 4 3.2;S 6 6 6文献标志码:AC l o n i n g a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i s o f t h e S-p r o t e i n H o m o l o g o u s G e n e(C r S P H)f r o m S h a t a n g j uWU X i u l a n1,T ANG W e n w u2*,XU C h e n g x i a n g2,L I G u i h u a3(1 S c h o o l o f F o o d a n d P h a r m a c e u t i c a l E n g i n e e r i n g,Z h a o q i n g U n i v e r s i t y,Z h a o q i n g,G u a n g d o n g 5 2 6 0 6 1,C h i n a;2 S c h o o l o f L i f e S c i e n c e s,Z h a o q i n g U n i v e r s i t y,Z h a o q i n g,G u a n g d o n g 5 2 6 0 6 1,C h i n a;3 V e g e t a b l e R e s e a r c h I n s t i t u t e,G u a n g d o n g A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,G u a n g z h o u 5 1 0 6 4 0,C h i n a)A b s t r a c t:S e l f-i n c o m p a t i b i l i t y i n C i t r u s w a s c o n t r o l l e d b y t h e S l o c u s g e n e,o n e s e l f-i n c o m p a t i b i l i t y r e l a t e d S-p r o t e i n h o m o l o g o u s g e n e(S PH)w a s s c r e e n e d f r o m S S H l i b r a r y i n t h e e a r l y s t a g e,b u t i t s f u n c t i o n i s s t i l l u n c l e a r.I n t h e s t u d y,t h e S PH g e n e w a s c l o n e d f r o m Wu z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j u b y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n P C R,n a m e d C r S PH.T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e C r S PH g e n e w a s a n a l y z e d b y q P C R.T h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n a n d p o l l e n g e r m i n a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e d.T h e r e s u l t s s h o w e d,(1)t h e C D S o f S PH g e n e w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d f r o m Wu z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j u,a n d t h e C D S w a s 4 1 7 b p e n c o d i n g a p r o t e i n o f 1 3 8 a m i n o a c i d s.T h e r e w e r e t h r e e b a s e p a i r s d i f f e r e n c e b e t w e e n Wu z i s h a-t a n g j u a n d S h a t a n g j u,w h i c h r e s u l t e d i n t w o a m i n o a c i d s m u t a t i o n.(2)T h e s o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n e x-p e r i m e n t s h o w e d t h e r e w a s o n e c o p y o f C r S PH i n t h e g e n o m i c D NA b o t h Wu z i s h a t a n g j u a n d S h a-t a n g j u.(3)T h e q P C R s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f C r S PH g e n e w a s s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t i n f l o w e r o r g a n s o f S h a t a n g j u,t h e h i g h e s t e x p r e s s i o n l e v e l w a s f o u n d i n o v a r y,a n d i t w a s h a r d l y e x p r e s s e d i n p e t a l s,f i l a m e n t s,a n t h e r s,s t i g m a s,s t y l e s.T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o f C r S PH g e n e w a s 1 6 t i m e s h i g h e r i n t h e o v a r i e s o f S h a t a n g j u t h a n t h a t i n o v a r i e s o f Wu z i s h a t a n g j u.(4)T h e h i g h e s t e x p r e s s i o n o f t h e C r S PH g e n e w a s d e t e c t e d a t t h e 6t h a n d 7t h d a f t e r o u t c r o s s i n g(Wu z i s h a t a n g j uS h a t a n g j u)p o l l i n a t i o n,a n d t h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e t h a n t h e e x p r e s s i o n o f t h e C r S PH g e n e a t o t h e r p e r i o d s,t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o f C r S PH g e n e a t 6 d w a s 1 6 t i m e s h i g h e r t h a n t h a t a t 1 d.(5)T h e p r o k a r y-o t i c e x p r e s s i o n e x p e r i m e n t s u c c e s s f u l l y i n d u c e d t h e C r S P H h e t e r o l o g o u s p r o t e i n,a n d t h e p o l l e n g e r m i n a-t i o n e x p e r i m e n t i n v i t r o s h o w e d t h a t t h e p o l l e n g e r m i n a t i o n r a t e o f Wu z i s h a t a n g j u w a s s i g n i f i c a n t l y i n-h i b i t e d w i t h i n c r e a s i n g C r S P H p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s f r o m Wu z i s h a t a n g j u.T h e a b o v e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e C r S P H g e n e h a d t i s s u e e x p r e s s i o n s p e c i f i c i t y.W e s p e c u l a t e d t h a t t h e C r S P H g e n e m a y b e r e l a t e d t o s e l f-i n c o m p a t i b i l i t y o f C i t r u s.K e y w o r d s:S h a t a n g j u;C r S PH;e x p r e s s i o n a n a l y s i s;p o l l e n g e r m i n a t i o n;s e l f-i n c o m p a t i b i l i t y 在显花植物中,自交不亲和性(s e l f-i n c o m p a t i-b i l i t y,S I)被认为是防止自花授粉、促进异花授粉及产生新基因型的重要遗传机制。S I是由1个单一的复等位基因S位点所控制,以实现接受还是排斥自我的花粉1。S I系统可分为孢子体S I(s p o r o-p h y t i c S I,S S I)和 配 子 体S I(g a m e t o p h y t i c S I,G S I)。S S I和G S I由不同的S位点基因控制,以十字花科为代表的S S I 主要由S位点的S R K(S-r e-c e p t o r k i n a s e)和S C R(S-l o c u s p r o t e i n 1 1)基因控制2。这2个紧密连锁的S位点基因在柱头的乳突细胞中特异性表达,并在S I中控制柱头的功能3。以茄科为代表的G S I主要由雌蕊中的S-RN a s e和花粉 中S L F(S-l o c u s F-b o x)/S F B(S-h a p l o t y p e-s p e c t i f i c F-b o x)基因控制4。有关S-RN a s e研究较多,玄参科5、蔷薇科6、芸香科7、在茄科8等均有报道,不同S-RN a s e之间存在高度的多态性,其氨基酸序列的同源性介于3 8%9 8%之间9。在花粉S位点基因研究方面,L a i等1 0从金鱼草的B A C文库中筛选到1个A h S L F-S2基因,该基因与S2-R N a s e紧密连锁。S a s s a等1 1在梨中鉴定了5个F-b o x基 因,均 位 于Sn-RN a s e基 因 附 近。B e e c h e r等1 2报道除了关键S因子外,其他非关键因子也参与自交不亲和反应,如P C D1 3、S S K 11 4、C r S K P 1-e1 5、B r CML 4 91 6等。柑橘 属 于S-R N a s e介 导 的G S I,由 花 柱S-R N a s e和花粉S L F相互作用,通过抑制花粉管的生长实现自交不亲和性1 7。当花柱S-R N a s e进入花粉管后,非自我S-R N a s e会被S L F识别并被泛素化及降解,花粉管能正常延伸至子房受精。当自我S-R N a s e释放到花粉管中,会降解花粉管中的R NA,使得花粉管无法在花柱中生长,表现出自交不亲和反应1 8。沙糖橘是中国重要的柑橘品种,属于自交亲和品种。无籽沙糖橘 是 沙糖橘 的芽变体,属于G S I1 9-2 0,是研究自交不亲和的理想材料。课题组前期从无籽沙糖橘S S H文库中筛选到1个自交不亲和相关的E S T序列,序列比对为S-蛋白同源基因(S-p r o t e i n h o m o l o g o u s g e n e,S PH),柑橘S PH基因的相关研究尚未见报道。本研究以甜橙(C i t-r u s s i n e n s i s)的S PH基因序列(C s 5 g 3 4 5 8 0.1)为参照,克隆了 沙糖橘C r S PH基因的C D S和D NA序列,并分析其在花器官不同部位、授粉后不同时段的表达量,同时研究该蛋白对 无籽沙糖橘、沙糖橘 花粉萌发率的影响,以期为研究C r S PH基因功能及在柑橘自交 不亲和反应 中 的 作 用 机 制 提 供依据。1 材料和方法1.1 试验材料试验用 无籽沙糖橘 及 沙糖橘 果树由肇庆市德庆县马圩镇果园提供,为7年生果树。于2 0 1 9年春季收集含苞待放花蕾,用镊子剥离出花瓣、花丝、柱头、花柱、子房、花丝和花药,液氮速冻后置于-8 0 冰箱,用于不同组织表达分析。收集自交(无籽沙糖橘 无籽沙糖橘)、异交(无籽沙糖橘 沙糖橘)后0,1,2,3,4,5,6,7 d的雌蕊,液氮速冻后置于-8 0 冰箱,用于授粉后不同时段的表达分析。收集 无籽沙糖橘 和 沙糖橘 花粉,置于-2 0 冰箱保存,用于体外花粉萌发实验。2621西 北 植 物 学 报 4 3卷1.2 试验方法1.2.1 C r S P H基因克隆采用R NA提 取 试 剂 盒 提 取 总R NA,采 用C T A B法2 1提取基因组D NA,采用L i f e T e c h n o l o-g y公司生产的M-ML V反转录试剂盒合成c D NA。参考甜橙S PH基因序列(C s 5 g 3 4 5 8 0.1)设计1对包含起始密码子和终止密码子的引物C r S P H-F/R(表1),扩增C r S PH基因的C D S和D NA序列,扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳并回收,获得目的基因片段。将目的基因与p MD 1 9-T克隆载体连接并转化感受态细胞DH 5,经3 7 过夜培养后,挑取3个阳性菌落经P C R鉴定正确后,送基因测序公司测序验证。利用 N C B I的b l a s t p 对C r S PH基因序列和蛋白序列进行分析,采用P r o t P a r a m在线工具分析蛋白质的等电点及分子量。利用在线 软件S i g n a l P 6.0对C r S P H蛋白进行信号肽分析。1.2.2 q P C R表达分析为分析C r S PH基因在花器官的不同部位及授粉后不同时段的表达量,利用q P C R技术检测花瓣、子房、花柱、柱头、花丝和花药等花器官,以及自交(无籽沙糖橘 无籽沙糖橘)、异交(无籽沙糖橘 沙糖橘)授粉后不同时段的基因表达量。根据C r S PH基因和柑橘A c t i n基因序列,分别设计符合q P C R要求的特异引物(q C r S P H-F/R)和内参引物(A c t i n-F/R)(表1),按照q P C R试剂盒(S Y B R G r e e n)说明书进行q P C R反应,反应体系为2 0.0 L,包括1 0.0 L S Y B R E x T a q,1 0 m o l/L引物各1.0 L,6.0 L d d H2O和2.0 L(8 0 n g)c D N A,扩增反应在A B I 7 5 0 0实时定量P C R仪进行。设置3次重复,每次用d d H2O做阴性对照,数据分析采用2-CT法计算2 2。表1 所用引物序列T a b l e 1 P r i m e r s f o r e x p e r i m e n t引物名称P r i m e r引物序列(5 3)P r i m e r s e q u e n c e(5 3)C r S P H-FC C G C A T GAA G T G G T T GA T G G T GAC r S P H-R T C AT C AT C T C T G G C A C T C C T G Cq C r S P H-FG C T C AA C A T T G GAA G C T C A T T G Cq C r S P H-RC T G G T C AT C AG G G C A G T AAA C A TA c t i n-FC C AAT T C T C T C T T GAA C C T G T C C T TA c t i n-RT GA C T GA T GA GAA C T G C C A GAA Gp E T 3 2 a C r S P H-FC G G A A T T C A T G A A G T G G T T G A T G G T G Ap E T 3 2 a C r S P H-RT A T A T G T C G A C T C T C T G G C A C T C C T G C1.2.3 S o u t h e r n杂交分析以1 0.0 g基因组D N A为模板,分别用限制性内切酶E c oR、S c a、C l a 于3 7 过夜消化,全部酶切产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳35 h,待全部产物分离后凝胶成像系统拍照,将其转入H y b o n d N+尼龙杂交膜。根据P C R D I G探针合成试剂盒说明书合成带有D I G标记的探针,于4 2 预杂交2 h后,加入制作好的探针过夜杂交;然后用2柠檬酸钠(s t a n d s a l i n e c i t r a t e,S S C)溶液(含0.1%S D S),再用0.5 S S C(含0.1%S D S)于6 5 洗脱2次,每次洗脱1 0 m i n;最后于暗室中将X-r a y胶片平铺到杂交膜并置于暗匣中,于3 7 曝光5 3 0 m i n。1.2.4 原核表达载体构建及C r S P H蛋白诱导设计含有B a mH I和S a l I酶切位点的引物p E T 3 2 a-C r S P H-F/R(表1),以p MD 1 9-C r S P H为模板扩增目的基因,获得带有黏性末端的目的基因。用B a mH I和S a l I双酶切线性化原核表达载体p E T 3 2 a,将带有黏性末端的目的基因与线性化的表达载体用T4 D NA酶 连 接,经 转 化、鉴 定 后 获 得p E T 3 2 a-C r S P H重组原核表达载体。将上述重组质粒转化至大肠表达菌株B L 2 1(D E 3),以空质粒为对 照。用1 mm o l/L I P T G诱 导 菌 株 表 达 获 得p E T 3 2 a-C r S P H融合蛋白,并经1 2%S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳。1.2.5 花粉萌发实验将原核诱导的C r S P H蛋白稀释成0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 g/L 5个浓度。花粉培养基配制按照M i a o等2 6的方法,分别取上述各浓度的 无籽沙糖橘 和 沙糖橘C r S P H蛋白2 0 0 L,加入到上述花粉培养基后分成2份:一份用于 无籽沙糖橘 花粉培养,一份用于 沙糖橘 花粉培养。相应花粉撒播至培养基后于恒温培养箱中2 8 培养1 0 h,以花粉管长度超过花粉粒直径作为萌发标准,在光学显微镜下观察并统计各处理的花粉萌发率,设置3次生物学重复,以未添加C r S P H蛋白组作为对照。2 结果与分析2.1 C r S P H基因克隆以 无籽沙糖橘 和 沙糖橘 的花蕾 c D NA 为模板,利用引物C r S P H-F/R进行P C R扩增,均得到约4 0 0 b p特异条带(图1),经回收、克隆后测序表明 无籽沙糖橘 和 沙糖橘C D S均为4 1 7 b p,编码1 3 8个氨基酸。两者间序列存在3个碱基差异,沙36218期 吴秀兰,等:沙糖橘S蛋白同源基因C r S PH的克隆与表达分析糖橘 第9 3位C突变为T、第1 9 0位G突变为A、第3 2 4位C突变G,从而导致 沙糖橘 第6 4位缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I),1 0 8位天冬酰胺(N)突变为赖氨酸(K)(图2)。利用C r S P H-F/R引物对2个材料的基因组D NA进行扩增及测序,其序列长度也是4 1 7 b p,表明 沙糖橘 和 无籽沙糖橘 基因组D NA均不含内含子。利用P r o t P a r a m预测 沙糖橘C r S P H蛋白显示其分子量为1 6.0 5 k D,理论等电点为8.4 8,S i g n a l P 6.0分析显示该蛋白不存在信号肽。M.M a r k e r;1.W u z i s h a t a n g j u;2.S h a t a n g j u.图1 沙糖橘 和 无籽沙糖橘C r S PH基因的P C R扩增结果F i g.1 P C R p r o d u c t o f C r S PH g e n e f r o m W u z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j uS T J.S h a t a n g j u;WZ S T J.W u z i s h a t a n g j u.图2 沙糖橘 和 无籽沙糖橘C r S PH基因比对F i g.2 S e q u e n c e s o f t h e C r S P H p r o t e i n f r o m Wu z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j u柱状图上不同小写字母表示花器官不同部位表达量差异显著(P0.0 5)。图3 C r S PH基因在 无籽沙糖橘 和 沙糖橘花器官不同部位的表达分析D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t e x p r e s s i o n d i f f e r e n c e s i n d i f f e r e n t p a r t s o f f l o r a l o r g a n(P0.0 5).F i g.3 E x p r e s s i o n a n a l y s e s o f C r S PH g e n e i n d i f f e r e n t p a r t s o f f l o r a l o r g a n f r o m W u z i s h a t a n g j u(WZ S T J)a n d S h a t a n g j u(S T J)2.2 不同部位花器官的基因表达分析采用q P C R技术对花瓣、花丝、花药、柱头、花柱和子房等花器官部位的C r S PH基因表达量进行检测,结果如图3所示,C r S PH基因在 沙糖橘 花器官不同部位的表达量差异较大,其中子房组织的表达量最高,且与其他部位表达量差异均达到显著水平;无籽沙糖橘 不同部位的表达量差异均未达到显著水平。在高表达的子房中,沙糖橘 表达量是 无籽沙糖橘 的1 6倍,表明C r S PH基因在 沙糖橘 中具有高度的组织表达特异性。2.3 自交和异交授粉后不同时段的基因表达分析利用q P C R检测了C r S PH基因在自交(无籽沙糖橘 无籽沙糖橘)和异交(无籽沙糖橘 沙糖橘)授粉后0,1,2,3,4,5,6,7 d的雌蕊组织表达量,相关结果见图4。由图4可知,异交授粉后第6,7天的表达量最高,与其他时段的差异均达到显著水平;异交授粉后第2 4天的表达量较高,与表达量较低的第1和第5天的差异达到显著水平,异交授粉第6天表达量是第1天表达量的1 2.4倍,表明C r S PH基因在异交授粉后不同时段的表达量差异显著。由图4可知,自交授粉后各时段的基因表达水平较低,其表达量呈现出先上升后下降的表达规律,以第3天的表达量最高,但不同时段的基因表达量差异未达到显著水平。2.4 S o u t h e r n 杂交分析利用C r S PH基 因 内 部 不 存 在 酶 切 位 点 的4621西 北 植 物 学 报 4 3卷E c oR I和S a c I酶以及存在1个酶切位点的C l a I酶对基因组D NA消化后,与D I G标记C r S PH基因的探针进行杂交实验,结果见图5。由图5可知,经E c oR I和S a c I消化的D NA杂交出1条杂交带,而经C l a I酶消化的D NA出现2条杂交带,表明C r S PH基因在 无籽沙糖橘 和 沙糖橘 基因组中均以单拷贝形式存在。柱状图上不同小写字母表示授粉后不同时间的表达量差异显著(P0.0 5)。图4 C r S PH基因在自交、异交授粉后不同时段的表达分析D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t e x p r e s s i o n d i f f e r e n c e s i n d i f f e r e n t s t a g e a f t e r p o l l i n a t i o n(P0.0 5).F i g.4 E x p r e s s i o n a n a l y s e s o f C r S PH g e n e i n d i f f e r e n t s t a g e s i n o v a r i e s a f t e r s e l f-p o l l i n a t i o n a n d c r o s s-p o l l i n a t i o nA.W u z i s h a t a n g j u,B.S h a t a n g j u.图5 C r S PH基因在 无籽沙糖橘 和 沙糖橘基因组中S o u t h e r n杂交分析F i g.5 S o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s o f t h e C r S PH g e n e i n Wu z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j u2.5 C r S P H蛋白诱导表达及对离体花粉萌发影响将线性化的p E T 3 2 a表达载体与带有B a mH I和S a l I酶切位点的目的基因连接后,经转化、培养、测序鉴定后,成功构建含有C r S PH基因的原核表达载体p E T 3 2 a-C r S P H。将该重组质粒转化大肠杆菌B L 2 1(D E 3),经I P T G诱导表达及S D S-P AG E电泳结果见图6。由图6可知,原核诱导表达的融合蛋白条带约3 7 k D,其中C K中的标签蛋白为2 1 k D,诱导获得的C r S P H蛋白约为1 6 k D,这与生物信息学预测的1 6.0 5 k D结果相吻合,表明该原核表达系统成功诱导表达出C r S P H蛋白。将上述异源表达的C r S P H蛋白稀释成0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 g/L浓度后添加到花粉培养基,观察其对花粉萌发率的影响,并以不添加外源C r S P H蛋白组为对照,结果见图7。由图7可知,无籽沙糖橘C r S P H蛋白对2种花粉萌发率有一定影响,随着异源 无籽沙糖橘C r S P H蛋白浓度增加,无籽沙糖橘 花粉萌发率显著性降低;但 沙糖橘 花粉在0.4,1.6 g/L的低浓度处理时萌发率较高,而在3.2,6.4 g/L的高浓度处理下萌发率反而下降。沙糖橘C r S P H蛋白对 无籽沙糖橘和 沙糖橘 的花粉萌发均无明显影响。M.M a r k e r;C K.H i s t a g s p r o t e i n;1.W u z i s h a t a n g j u;2.S h t a n g j u.图6 原核系统异源表达C r S P H蛋白F i g.6 H e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n o f C r S P H p r o t e i n f r o m W u z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j u u s i n g p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n图柱上不同字母表示不同浓度处理下的差异显著性(P0.0 5),*表示两材料间差异达到显著水平(P0.0 5),*表示两材料间差异达到极显著水平(P0.0 1)。图7 原核表达的C r S P H蛋白对花粉萌率的影响D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s o n t h e b a r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s w i t h WZ S T J(P0.0 5),*o n t h e b a r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n WZ S T J a n d S T J(P0.0 5).F i g.7 E f f e c t o f C r S P H p r o t e i n o n p o l l e n g e r m i n a t i o n f r e q u e n c y o f W u z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j u56218期 吴秀兰,等:沙糖橘S蛋白同源基因C r S PH的克隆与表达分析3 讨 论多数果树属于配子体自交不亲和,其自交不亲和性是雌蕊关键因子S-RN a s e基因和花粉关键因子S L F/S F B基 因 相 互 作 用 结 果7,1 7,2 3-2 5。L a i等1 0在研究金鱼草花粉自交不亲和反应中,将金鱼草花粉特异表达A h S L F-S 2基因和雌蕊特异表达的A h S2-RN a s e基因转入矮牵牛(P e t u n i a h y b r i-d a),结果分别在转基因矮牵牛的花粉和雌蕊中检测这两个基因的表达量,Q i a o等2 6进一步通过花粉实验证明转了A h S L F-S 2和A h S2-RN a s e基因的矮牵牛由S I转变成S C。然而蔷薇科花粉自交不亲和反应并非由于基因表达量差异导致,而是花粉S基因编码区发生了碱基的替换、缺失,导致S蛋白发生改 变,从 而 导 致 由S I向S C转 变2 7。S a s s a等4发现S C突变体O s a-N i j i s s e i k i 是由于S I日本梨N i j i s s e i k i 的S4-RN a s e基因发生了突变,使得S4-RN a s e基因不能在花柱表达,导致S I向S C突变。U s h i j i m a等2 8在梅(P r u n u s m u m e)中获得花粉突变造成的自交亲和单体型Sf,Sf基因结构中有6.8 k b p碱基插入,造成编码的F-b o x蛋白缺少了C-端 序 列,从 而 造 成 亲 和 突 变。本 研 究 中,C r S PH基因在 沙糖橘 和 无籽沙糖橘C D S序列存3个碱基的差异(CT,GA,CG),导致2个氨基酸残基发生改变(VI,NK)。在C r S PH基因在特异性表达的子房部位,沙糖橘 表达量是 无 籽 沙 糖 橘 的1 6倍,推 测 无 籽 沙 糖 橘 的C r S PH基因突变和子房中低水平表达可能与其自交不亲和表型相关。植物自交不亲和主要由1个单一的复等位基因S位点控制,该基因座上存在2个紧密连锁且分别在花柱和花粉中特异表达的基因,分别是雌蕊决定因子S-RN a s