蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法).doc

蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）

一、目的
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理
考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料
1．仪器
      （1）分析天平      （2）具塞刻度试管     10ml× 8      （3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I      （4）研钵      （5）漏斗      （6）离心管     10ml      （7）容量瓶     10ml
      （8）离心机      （9）721型分光光度计
2．试剂
    （1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pg／ml的原液。
    （2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3．材料
    绿豆芽
四、操作步骤
1．标准曲线的制作    取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。

管     号

操作项目 1       2         3          4        5         6
标准蛋白质溶液(ml) 0      0.2       0.4       0. 6       0.8        1.0
蒸馏水(ml) 1.0      0.8       0.6       0.4        0.2        0
G-250试剂(ml) 各5
蛋白质含量（μg） 0       20       40        60        80       100

 盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定
（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。
（2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
  样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml）／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））
六、注意事项
    比色应在出现蓝色2 min～l h内完成。

作者：吕淑霞 来源：生物秀 时间：2008-5-21
一、目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
新鲜绿豆芽
2．主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架
（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计
3．试剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇
（4）磷酸（85％）
四、操作步骤
1．标准曲线制作
（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
（2）0~1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg／mL 的标准曲线。
表2 高浓度标准曲线制作
2．样品提取液中蛋白质浓度的测定
（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL 容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。
（2）测定：另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1 号试管做空白。
五、结果计算
式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。
 六、附 注
1．Bradford 法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。
3．蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其
结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。
七、思考题
1．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？
参考答案
1．将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。
蛋白质含量测定的方法(Bradford 方法)
原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford储存液    100ml95%乙醇      200ml88%磷酸
350mgServaG蓝      室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液       425ml双蒸水       15ml95%乙醇       30ml88%磷酸       30ml Bradford储存液
用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做标准曲线：
取样品即可测量。
注意事项：
1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题， ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度