毕业论文（设计）成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究.pdf

成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究摘 要诱导多能干细胞(ind uced pluripotent stem cells,iPSc)是利用病毒载体将 特定转录因子组合转入分化细胞，使其重编程为类似胚胎干细胞的一类细胞。它不仅 具有自我更新和多向分化潜能，而且在细胞形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状 态、类胚体和畸形瘤生成能力等方面都与胚胎干细胞相似。该技术是2006年由 Y amanaka将重组有0ct3/4、Sox2、c-Myc和K lf4四个转录因子基因的病毒载体引入 小鼠成纤维细胞，并成功诱导其重编程而最先创建的。在随后的研究中，如何选用来 源便捷、数目充足的成熟体细胞为重编程的靶细胞，成为iPS研究的热点之一。而具 备上述选材条件的成熟T淋巴细胞，却存在体外成活时间短和病毒转导效率极低等技 术难题。慢病毒(lentivirus)载体是以人类免疫缺陷I型病毒(H I V-1)为基础发展起来 的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感 染能力。在相关的细胞实验操作中，对于一些按常规方法难以转入甚至无法转入的细 胞，如原代细胞、干细胞等未分化细胞，通过慢病毒介导的方法能够大大提高基因的 转导效率，而且使目的基因整合到宿主细胞基因组的几率也明显增加，这为报告基因 在细胞内的高效瞬时表达研究提供了有利途径。本研究建立了适合小鼠成熟活化T淋巴细胞体外长时间培养，以及慢病毒转导的 技术平台，获得的主要研究结果如下：1、成熟T淋巴细胞的增殖与活化。采用Ficoll梯度离心法分离小鼠单个核细胞,分别用刀豆蛋白A(C onA)和anti-mouse C D3&anti-mouse C D28等方法活化成熟T 淋巴细胞，并利用流式细胞法检测T细胞表面C D4+C D44high等活化标志；竣基荧光素 双乙酸盐-琥珀酰亚胺酯(C FSE)示踪法检测活化细胞的增殖分裂状况。结果显示：可从3月龄的雌性Balb/c小鼠(SPF级)的脾脏中分离到2x107单 个核细胞；96孔型板经anti-mouse C D3&anti-mouse C D28(终浓度分别为2 pig/mL.4 pig/mL)包被后，可使2.OxlO,个细胞/孔在第三天(D3)迅速增殖至1.6xl06 个细胞/孔，经过 anti-mouse C D3&anti-mouse C D28 刺激活化的 C D4*C D44Hl如 T 淋 巴细胞占活细胞总数的(74.0+1.8)%,且C FSE强阳性细胞由原来(92.3+2.8)%降至(16.34+1.3)%；该活化T淋巴细胞在含I L-2(终浓度30 ng/mL)C TL培养基中可维 持生长(D14细胞数为1.5义1。6/孔)；而经C onA刺激激活的T淋巴细胞在D7才能达 到最高值L 4x106个细胞/孔，且随着培养时间延长，细胞凋亡增多，直至完全死亡。实验评价了小鼠成熟T淋巴细胞在体外培养条件下能否保持长期的增殖与活化状况-1-第二军医大学硕士学位论文的可行性，为下一步进行G FP重组慢病毒转导奠定基础。2、慢病毒的包装及对成熟T淋巴细胞的转染效率。采用脂质体将G FP重组慢病 毒质粒转染到包装细胞293T中，48小时后收集细胞上清液，进一步用超速离心的方 法纯化G FP重组慢病毒，转导LE PC细胞D2后，采用流式细胞法检测其转染效率和病 毒滴度。最后将纯化的G FP重组慢病毒分别按MOI=1,5,10等不同滴度，转染经 anti-mouse C D3&anti-mouse C D28刺激激活的T淋巴细胞，并观测G FP重组慢病 毒对T淋巴细胞的转染效率。结果显示：经脂质体法将G FP重组慢病毒质粒转染到包装细胞293T,在48小时 后,293T全部带有绿色荧光，转染效率为95%以上。未纯化的G FP重组慢病毒颗粒(500 此病毒/孔)转导LE PC细胞，经流式细胞仪分析G FP的阳性率为(85.93.6)猊 而 经超离纯化浓缩10倍的重组慢病毒组(50 piL病毒/孔)，其G FP阳性率仍达(74.3 1.8)%o纯化后的G FP重组慢病毒转染经anti-mouse C D3&anti-mouse C D28刺激激 活的T淋巴细胞3天后，G FP阳性率分别为:M0I=l组(25.8+1.75)%,M0I=5组(36.0 9.5)%,M0I=10组(43.0+4.75)%；与同滴度的腺病毒相比，其转染T淋巴细胞的 效率有较明显地提高；且随着G FP重组慢病毒滴度的增加，对T淋巴细胞的转染效率 也愈高。有关进一步提高慢病毒对该T淋巴细胞转导效率的实验目前仍在进行中。该技术体系的建立与不断完善，为下一步用肝特异性转录因子诱导成熟T淋巴细 胞分化为肝干细胞准备了条件。关键词：诱导多能干细胞，慢病毒转染，T淋巴细胞，流式细胞法-2-成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究ABSTRACTI nduced pluripotent stem cells,commonly abbreviated as iPS cells or iPSCs,are a type of non-pluripotent cell,such as an adult somatic cell,derived by viral transfection of certain stem cell-associated genes and reprogrammed to induce a forced”expression of specific genes.With potencies of sei住renewing and multi-direction differentiation,I PS cells are similar to pluripotent stem cells in many respects,such as the morphology of cell,the expression of certain stem cell gene and proteins,chromatin methylation patterns,the capability of embryoid bodies and teratoma formation.I PS cell was first generated by Shinya Yamanakas team in 2006 that successfully reprogrammed the mouse fibroblasts transduced by the recombinant retroviuses carrying four key pluripotency genes(Oct-3/4,SOX2,c-Myc,and Klf4),respectively.As for iPS cells,sufficiency and readily availability of the somatic cells reprogrammed are very critical.However,mature T lymphocyte was limited to be one candidate due to its short lifespan and very low efficiency of transduction.Certain Lentivirus derived from the human immunodeficiency virus type I(HI V-1),replicating in both dividing and non-dividing cells whereas a standard retroviral vector does,can introduce a gene into abnormal cells and treat various disease as a gene therapy tool.Another common application of the lentivirus is to deliver a reporter gene into some cells,such as primary-,stem-and other undifferentiated cells,to improve its transduction efficiency greatly and achieve high expression level of target gene in the above cell transiently.I n addition,the lentivirus can also increase the frequency of extra gene integrated with the genome of host cell.This study established fbr the activation of mature T lymphocytes in mice cultured in vitro fbr a long time,and lentiviral transfection technology platform,the main results obtained are as follows:1.Mature T lymphocyte proliferation and activation.The mononuclear cells were separated by the Ficoll gradient centrifugation and were then treated with concanavalin A(ConA)and anti-mouse CD3 plus anti-mouse CD28 to activate the mature T lymphocytes,respectively.The activated T cells were confirmed by mononuclear cell surface marker via flow cytometry(FACS)as CD4+CD44hlgh.The lymphocyte proliferation were monitored by Carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester(CFSE)labelling.-3-第二军医大学硕士学位论文As a result,2x 107 mononuclear cells could be isolated from each 3-week old mouse.Applyied to a 96-well round-bottom plate pre-coated by 2/mL anti-mouse CD3plus 4|ng/mL anti-mouse CD28,2x 105 cells/well could rapidly proliferate to 1.6 xlO6 cells/well after 3 days.Moreover,C D4+C D44hlgh subset accounted for(74+1.8)%of the total cells and occurred an abruptly d ecline of percentage of C FSEhlgh group from(92.3 2.8)%down to(16.34+1.3)%.The survival of activated T lymphocytes could be maintained in CTL medium in presence of 30 ng/mL I L-2(with 1.5 X 106 cells/well at 14 days post activated).Comparatively,the lymphocytes stimulated by ConA need to arrive the top level of 1.4x106 cells/well at seventh day,and subsequently progressed to die with longer incubation time.The first part of our experiment evaluated the availability of extending the lifespan of mature T lymphocytes activated in vitro,so as to render its tranfection by lentivirus further.2.Lentivirus packaging and mature T lymphocytes on tranfection efficiency.The recombinant GFP and lentiviral vector packaging plamids were co-transfected 293T cells using Lipofectamine 2000 transfection agents and then collected the cell supernatant after 48 hrs followed purified by ultra-centrifuge.The titer of the purified virus with the GFP as a reporter was measured by tranfected LEPC via FACS.Then,the mature T lymphocytes activated by anti-mouse CD3 plus anti-mouse CD28 were tranfected by the purified lentiviral GFP at MOI of 1,5,10 lU/cell,respectively and detected their tranfection efficiencies by FACS.As a result,all the 293T packaging cells were GFP positive 48 hrs posttransfection,leading to 95%above transfection efficiency.Moreover,(74.31.8)%of LEPC tranfection by purified lentivirus(50 piL/well)were GFP positive,comparable to the efficiency of those(85.9+3.6)%tranfection by unpurified lentivirus(500 L/well).Similarly,the MOI-dependent tranfection efficiency was found in the mature activated T lymphocytes:after 3 days,the percentages of GFP positive cells were(25.8+1.75)%,(36 9.5)%and(434.75)%at MOI of 1,5,10 lU/cell,respectively.The research to further improve the lentiviral tranfection efficiency of T lymphocytes is ongoing.Establishment and optimization of the technique will be useful in the study of inducing the mature T lymphocytes by liver-specific transcription factors and reprogramming into liver cells directly in future.KEY WORDS:iPSc,lentiviral tranfection?T lymphocyte,FACS-4-成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究缩略词表英文缩写英文名称中文名称E Scembryonic stem cells胚胎干细胞iPScI nd uced pluripotent stem cells诱导性多能干细胞ME Fmouse embryonic fibroblast小鼠胚胎成纤维细胞PBMCperipheral blood mononuclear cell外周血单核细胞AgAntigen抗原C DC luster of Differentiation白细胞分化抗原TC RT cell receptorT细胞受体MH CMajor histocompatibility complex主要组织相容复合体I TAMI mmunoreceptor tyrosine-based activatory motif免疫受体酪氨酸活化基I L-2I nterleukin-2白细胞介素2SLSplenic lymphocyte脾淋巴细胞C onAC oncanavalin A刀豆素AC FSEcarboxyfluorescein酸基荧光素二醋酸盐琥d iacetatesuccinimid yl ester珀酰亚胺酯FACSfluorescent-activated cell sorting流式细胞术PBSphosphate buffered saline磷酸盐缓冲液BSAbovine serum albumin牛血清白蛋白NE AAnon-essential amino acid非必需氨基酸H E PE S4-(2-H yd roxyethyl)-1-piperaz ineethanesulfonic acid4-羟乙基哌嗪乙磺酸E DTAE thylene Diamine Tetraacetic Acid乙二胺四乙酸DMSODimethyl Sulfoxide二甲基亚硼P/SPenicillin/Streptomycin青/链霉素FI TCFluorescein isothiocyanate异硫氟酸荧光素PEPhycoerythrin藻红蛋白M.O.IMultiplicity of infection复合感染G FPG reen Fluorescence Protein绿色荧光蛋白-5-独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责 任。学位论文作者签名:日期：年 月日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二 军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全 文或部分内容编入中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位 论文全文数据库等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名:导师签名:日期:年 月 日日期:年 月 日第二军医大学硕士学位论文-XX.1刖 百2006年，Y amanaka将0ct4、Sox2、c-Myc和K lf4四个转录因子导入小鼠胚胎成纤 维细胞(mouse embryonic fibroblast,ME F),转录因子的异位表达能够让体细胞“重 新编排”基因，使得体细胞初始化为胚胎干细胞的状态，即获得类似于胚胎干细胞(embryonic stem cells,E S细胞)的多能干细胞，命名为“诱导多能干细胞”(ind uced pluripotent stem cells,iPSc)o iPSc具有同胚胎干细胞(E SC s)类似的特性并能在 适当的诱导条件下分化为3个胚层的细胞，是具有多能分化能力的干细胞。这一研 究出现，不但成功跨越了长期困扰胚胎干细胞研究的伦理问题，为科学研究和临床应 用提供了新的细胞来源，而且疾病特异iPSc的诱导成功更为体外研究遗传疾病发生、发展和组织形成提供了更加广泛和大量的研究模型，并将有力推动基因治疗和药物研 发的发展。虽然iPSc具有非常高的取用价值和前景，但目前仍有几大问题阻碍着iPSc 应用于临床：l)iPSc的供体细胞。现在的大部分研究中iPSc来源多为皮肤成纤维细胞,通常要从皮肤穿刺获得(一般地是两块小于5立方毫米厚的皮肤组织)或抽取骨髓获 得7”这样给患者增加了很多痛苦。因此，需要寻找一种取材方便的种子细胞来代 替成纤维细胞，并希望这种细胞不仅具有易获得性，而且应数量充足；2)诱导效率非 常低。不管是采用Y amanaka或Thomson的方法，通常从皮肤穿刺到培养出足够细胞至 少需要4周，使用Y amanaka4种转录因子(0ct4、Sox2、K lf4和c-Myc)的初始化效率 也很低(V0.01%)。低效率成为进行大规模iPSc分子机理研究的主要障碍。如何改 进iPSc这几大缺陷，是该研究领域目前的热点问题。在产生iPSc的供体细胞中，人类外周血单核细胞比其他的细胞类型具有优 势。外周血单核细胞的获得比较方便，而且对人体有更少的侵害性。外周血 单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是从成人普通循环血液中抽 取中易获得大量的成熟血液细胞，含有大量的血细胞和单核细胞，满足了iPSc来 源的体细胞不仅具有易获得性，且数量充足。而且，外周血单核细胞从血液中分离 出来后就可以立即用于重编程，这可以减少了iPSc细胞系建立的总时间，而皮肤 或角质细胞从活体组织分离出来后则需要几周的培养时间才能获得原始的细胞。据报 道，最早用于重编程的单核细胞是小鼠的B淋巴细胞。Hanna等因应用“第二重编程系 统”，即将编码0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4转录因子基因并带有筛选标记doxycyclin的 慢病毒载体，转导到小鼠的胚胎成纤维细胞中第一次诱导为多潜能性细胞，然后将这 些第一次诱导的多潜能性细胞注射到小鼠的囊胚泡中获得嵌合体小鼠，B淋巴细胞被 分离出来代表发育的不同阶段，并且受到由doxycyclin诱导的四个转录因子的重编程 作用，诱导其回到幼稚阶段。这提供了证据证明了，分化的细胞，例如小鼠的B淋巴细-6-成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究胞通过过表达特定的转录因子可以直接变成诱导性多能干细胞。Loh等从一个健康 的献血者的外周血中分离出表达C D34阳性的造血干细胞，经粒细胞集落刺激因子激活 后将编码四个重编程转录因子的逆转录病毒转染入上述的造血干细胞中，使其重编程 为iPScG iorgetti等的只使用Sox2和0ct4两个转录因子将脐带血表达C D133的细胞重 编程为iPS细胞。程临钊I等人探讨了骨髓表达CD34的细胞用于重编程的可行性。他 们发现，冻存达9年之久的表达CD34的骨髓细胞，在用逆转录病毒转导后在胚胎干细 胞培养条件下进行培养，可以出现iPSc样克隆。经过进一步的扩增，这种iPSc克隆显 示出胚胎干细胞的形态和增殖特性。紧接着，程临钊组在另一实验中，用piggyBac 脱氧核糖核酸转座子转染到脐带血和表达CD34的外周血细胞中，也可以获得人类的 iPSc12o目前，程临钊实验组又将编码四个转录因子的质粒转染到人类表达CD34的 造血干细胞中，iPS克隆样细胞比转染到成纤维细胞更容易出现口式Takenaka】等将 P53基因敲除后，脐带血CD34细胞诱导为iPSc的效率明显提高，这与成纤维细胞在做 了上述处理后有相似的结果，暗示了成纤维细胞与血细胞的重编程进程的机理是基本 相似的621。由于T淋巴细胞在外周血单核细胞占有很大的比例，所以相继有实验室 将目光瞄准了T淋巴细胞，采用血液中的PBMC进行iPSc方面的研究囚-26。Seki等在 2010年从1毫升的血液中用Ficoll试剂提取T细胞，体外将T淋巴细胞培养在含有抗CD3 单克隆抗体和I L-2的培养基中，因为PBMC中含有淋巴细胞和单核细胞，通过这种方 法可以将T淋巴细胞选择性培养出来。在这种环境下，T淋巴细胞可以连续不断的增 殖。在T淋巴细胞被分离出的第5天，用流式细胞仪分选出具有CD3阳性的T淋巴细胞 继续培养。在T淋巴细胞被分离出的第6天，通过仙台病毒将4种转录因子（0ct4、Sox2、K lf4和c-Myc）导入T淋巴细胞，因为仙台病毒是一种单链RNA病毒，并不能整合到寄 主的基因组中，并且这种仙台病毒是对温度敏感的变异病毒，可以产生较弱的基因表 达，在标准培养温度下，仙台病毒不能增殖。病毒即使感染了细胞，也只会停留在细 胞质中，不会侵入细胞核，因此不会损伤细胞DNA,具有细胞癌变风险低的优点。在 T淋巴细胞被分离出的第8天，将T淋巴细胞转移到铺有转染了新霉素（neo）和白血 病抑制因子（LI F）的小鼠永生化胚胎成纤维细胞上（SNL细胞）。在T淋巴细胞被分离 出的第9天，培养基换为人的E S细胞培养基，含有4 ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FG F）o在转染T淋巴细胞后三周之内，可以观测到具有 类似人的E S细胞的克隆。在第25天，克隆增大并且形态上类似人的E S细胞的克隆。使 用的病毒滴度对转染的T淋巴细胞的毒性降低到最小，分别用M0I=3,M0I=5,M0I=10 和M0=20做平行实验，产生I PS细胞克隆的效率取决于病毒的滴度，转染病毒滴度为 M0I=20,在小鼠胚胎成纤维细胞（SNL）滋养层上约5万个细胞中，具有胚胎干细胞形 态和干细胞表面标记碱性磷酸酶（ALP）的结晶紫染色阳性的活细胞约50个克隆，占-7-第二军医大学硕士学位论文0.1%,分别是滴度为MOF3的10倍，是滴度为MOI=5的5倍，是滴度为M0F10的2.5倍。供体来源于丁淋巴细胞的I PS细胞命名为TiPS(TiPSC s)o将具有胚胎干细胞形态和干细胞表面标记碱性磷酸酶(ALP)阳性克隆TiPS细胞,进行干细胞全能性因子Nanog、0ct4、Sox2、K lf4 cMyc、Dgf3 Dppa2 Dppa4和Rexl 的反转录PC R,显示TiPS细胞与人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hE S细胞)有着相当的水平。进行hE S细胞标记0ct4、Nanog Ssea3,Ssea4 TraT-60和TraT-81 免疫染色，结果呈阳性。相反，未转染的的T淋巴细胞在这些基因表达水平上很低或 没有表达。TiPS细胞在体外形成类胚胎，能够分化为内胚层，中胚层和外胚层，注射入重 症联合免疫缺陷无胸腺小鼠6-8周后，TiPS细胞在体内分化成畸胎瘤，包含所有三 种胚层比如神经上皮细胞(外胚层)、平滑肌和脂肪组织(中胚层)和肠上皮和呼吸 上皮(内胚层)。总而言之，外周血单核细胞为iPS细胞提供了更好的体细胞来源，未来有望利用 这方便大量的外周血单核细胞资源培养医学上所需的各种类型的细胞。-8-成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究实验材料一、主要器材和设备自动温控C 02培养箱：H eraeus 5060/BB16超净台：购自苏州净化设备厂半自动高压锅解剖显微镜:Nikon SMZ 645超低温冰箱:Forma Scientific I nc.液氮罐：Forma Scientific I nc.超纯水制备系统：Labconco Water PROPS一次性培养瓶、培养皿及培养板：购自G eriner或C orning公司水平离心机：E ppend orf5804,购自德国艾本德公司低温离心机:购自H I TAC H I公司高速冷冻离心机：H itachi H I MAC C R21光学显微镜、显微摄影装置:购自OLY MPUS公司电子显微镜：H itachi H-800荧光显微镜及其摄影装置：Nikon E C LI PSE TE 2000-U倒置相差显微镜及显微摄影装置：NikonTMS显微镜和H FX-DX显微摄影系微量加样器：购自G ilson吉尔森公司流式细胞仪：MAC SQuanM购自Miltenyi Biotec德国美天旎生物技术有限公司凝胶成像分析仪：购自上海复日公司微型台式真空泵：购自绍星wz-II型自动温控水浴箱电子天平：购自上海精密仪器厂分析天平：Sartorius BS124SPH 计：Jenway 3510紫外分光光度仪：购自E ppend orf德国艾本德公司淋巴细胞分离器材：解剖器械包（内含若干套大剪刀、组织镶、针器）200目钢网（购自Amersham公司）、70目尼龙滤网、10 cm培养皿、50 mL离心 管、15 mL离心管、10 mL移液管、E P管、1mL注射器、以上相关材料实验前进行消 毒-9-第二军医大学硕士学位论文二、主要试剂及其制备(一)淋巴细胞分离及培养用溶液配制及准备1、双蒸水d d lW(pH 7.0),高压灭菌。血红细胞裂解液：AC K裂解缓冲液NH4C 1(0.15 mol/L)K H2C O3(10.0 mmol/L)Na2E DTA(0.1 mmol/L)8.29 g1 g37.2 mg力口 800 mL d d H20 水,用 1 mol/L 盐酸调 pH 至 7.27.4,补力口水至 1 L,0.2 pirn 滤膜过滤除菌，室温保存。3、小鼠淋巴细胞分离液(Lympholyte-M,C L5031):lymphocyte Separation Med ium(LSM),购自 C ed arlane 公司4、H anks 液：NaC l 8.01 gK C 1 0.4 gNaH P04 0.35 gK H2P04 0.06 gG lucose 0.34 g/LC aC l2 0.14 g先将上述几样配好，然后单独溶解C aC k,再将其倒入配好的溶液中，加超纯水 定容至1000 mL,用10 M NaOH调节pH至7.37.6,于4保存。5、吉姆萨(G iemsa)染液的制备：甲液：取瑞氏染粉1 g,吉姆萨染粉0.3 g,置于干燥清洁研钵中，另备甲醇(不含水或丙酮)500 mL分数次加少量甲醇研磨，分次收集于棕色玻璃瓶中，每天 早晚各摇3分钟，经1星期后即可使用。乙液:(磷酸缓冲液PH值6.87.0)：K H 2P。4 0.3 gNa2H P04 0.2 g加适量水溶解，校正pH值，加水至1L,加入0.01%TritonX100改善染色性。6、磷酸盐缓冲液PBS：1M磷酸盐缓冲液(10XPBS):-10-成熟T淋巴细胞分离培养及其慢病毒介导的基因转染的研究NaC l 80 gK C 1 2 gK H2P04 2.4 gNa2H P04 12H2O 35.6 g将上述试剂依次溶于800 mL去离子水中，完全溶解后，用10M NaOH调节pH至7.4 左右，加超纯水定容至1000 mL,115高压灭菌10 min20 min,存在4冰箱中备 用。0.1M磷酸盐缓冲液(1XPBS):1M磷酸盐缓冲液 100 mL超纯水 900 mL用10M NaOH调节pH至7.4左右，加超纯水定容至1000 mL,115高压灭菌10 min20 min,存在4冰箱中备用。7、青霉素/链霉素溶液(P/S 100X)：10000 units/mL青霉素和10000 比/mL链 霉素的盐溶液，购自G ibcolBRL公司。8、RPMI-1640液体培养基：取RPMI-1640培养基干粉(G ibcolBRL公司，1X1L)1 包，加入800 mL超纯水充分溶解，加入NaH C 032.7 g,加G lutamaxTM至终浓度为1 mM,加青霉素/链霉素溶液或庆大霉素溶液至终浓度分别为100 pig/mL,100 pig/mL,50 pig/mLo定容至1000 mL,0.22卬1除菌滤膜过滤后分装，-20保存,使用前4解冻过 夜。9、200 mM G lutamaxTM:购自G ibcolBRL公司,-20C保存。10、NE AA(non-essential amino acid):购自G ibcolBRL公司，4保存。11、丙酮酸钠(Sod ium pyruvate：100 mM)：购自Sigma公司，4保存。12、H E PE s溶液(1 M)：取23.8 g H E PE S干粉(购自上海生工)溶于90 mL双 蒸水中，用10 M NaOH调pH至7.27.4,然后用超纯水定容至100 mL,0.22 pirn除菌 滤膜过滤除菌，分装小瓶(2mL/瓶)，4保存。13、2-筑基乙醇(2-Mercaptoethanol：1000X)：购自 G ibcolBRL 公司，4保存。14、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)：购自H yclone公司。用前56水浴灭 活30 min,-20保存,使用前4解冻过夜。15、C TL培养基:RPMI T640液体培养基 500 mLFBS(10%)50 mL丙酮酸钠(100 mM)5 mL-11-第二军医大学硕士学位论文青霉素/链霉素溶液(100 X)5 mLH E PE s 溶液(I M)5 mLNE AA 5 mL2-筑基乙醇(1000X)500 piL16、0.4%台盼蓝工作溶液：称取0.4 g台盼蓝粉剂，溶于100 mLPBS中，调节pH 至7.2,室温保存。17、C onA液:购自Sigma公司，用C TL培养基配制成100)Lig/mL,再以0.2卬1滤器滤 除不溶物等杂质及细菌，分装后避光保存于-20冰箱备用。18、抗小鼠白细胞分化抗原3单克隆抗体(anti-mouse C D3 monoclonal antibod y：1 mg/mL):购自eBioscience公司。19、抗小鼠白细胞分化抗原28单克隆抗体(anti-mouse C D28 monoclonal antibod y：1 mg/mL):购自eBioscience公司。20、白细胞介素-2(I L-2贮存液)：购自PE PROTE C H公司。将I L-2溶于0.1%BSA中，终浓度为1 pig/mLo21、DME M液体培养基：取DME M培养基干粉(G ibcolBRL公司，1X1 L)1包，加入 800 mL超纯水充分溶解，加入碳酸氢钠2.7 g,加G lutamaxTM至终浓度为1 mM,加青霉 素/链霉素溶液或庆大霉素溶液至终浓度分别为100 pig/mL,100 pig/mL,50pig/mLo 定容至1000 mL,0.22pim除菌滤膜过滤后分装，-20保存,使用前4解冻过夜。22、DME M完全培养基：DME M液体培养基，添加10%的胎牛血清，4保存。23、细胞冻存液：DME M液体培养基70 mL,添加20 mL胎牛血清以及10 mLDMSO,分 装后-20。保存，使用前4。解冻。24、0.5%胰蛋白酶/E DTA(10X)：购自G ibcolBRL公司。0.05%胰蛋白酶/E DTA工 作液：取10X0.5%胰蛋白酶/E DTA 4 mL,力口1 XPBS至40 mL,4保存。25、0.2%明胶:取明胶粉剂2 g,置于1L大烧杯中，加水700-800 mL,37水浴至完 全溶解，定容至1000 mL,以0.65卬1滤膜过滤后，分装，高压灭菌