总糖和还原糖的测定.doc

总糖和还原糖的测定（3,5—二硝基水杨酸法）实验报告
前言
糖在我们日常生活中随处可见，我们吃的米饭、水果、零食中或多或少都含有一些糖类。同时，糖也是我们维持机体运动所必不可少的物质，没有了它，就没有了能量的来源。我们这次便走进实验室探索糖类的奥秘。本次实验我们将用3,5—二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖中的含糖量。本次实验中，我们除了要掌握还原糖和总糖的测定基本原理还要学习比色法测定还原糖的操作方法以及分光度法测定的原理和方法。
首先，让我们一起来了解一下它们的测定方法吧。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以09。

一、实验目的
1、掌握还原糖和总糖的测定的基本原理
2、学习比色法测定还原糖的操作方法
3、学习分光光度法测定的原理和方法

二、实验原理
　还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、材料与器具的准备。
实验材料：面粉。
实验试剂
（1）、1mg/mL葡萄糖标准液
　　　准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
　　　将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
（3）、碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。
（4）、酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。
（5）、6M HCl和6M NaOH各100mL。
实验器材
（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11
（2）大离心管：50mL×2
（3）烧杯：100mL×1
（4）三角瓶：100mL×1
（5）容量瓶：100mL×3
（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1
（7）恒温水浴锅
（8）沸水浴
（9）分光光度计
分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合比色原理——Lambert-Beer's law:
数学表达式:
A=lg(1/T)=KCL
A为吸光度 T为透射率,是投射光强度比上入射光强度
C为吸光物质的浓度 L为吸收层厚度 K为吸收系数 物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度L成正比.

四、实验步骤。
器材与材料准备完毕之后，便开始按照以下步骤进行实验。首先，制作葡萄糖标准曲线。取6支20mL 具塞刻度试管编号，按下表分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

管
号
试
剂

0
1
2
3
4
5
标准葡萄糖溶液\ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水\ml
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
DNS试剂\ml
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5

接下来，提取还原糖。准确称取2.00g 食用面粉，放入100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL 蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。过滤将滤液收集在100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
紧接着，提取总糖。准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1 滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH 中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
然后，取4支20mL 具塞刻度试管，编号，6、7、8、9，按下表所示分别加入待测液和显色剂。

管号
还原糖待测液（ml)
总糖待测液
（ml)
蒸馏水
（ml)
DNS
（ml）
6
0.5

1.5
1．5
7
0.5

1.5
1．5
8

1
1
1．5
9

1
1
1．5
最后，用分光光度计进行比色。先将机器打开预热20分钟。选择540nm的波长。再按MODE键切换到T，将黑体放入光路中，合上盖，0键校零。再按MODE键切换到A，将倒入比色皿中的0号液体放入到光路中，合上盖，100键校零。再将倒入比色皿中的各号液体放入到光路中即可测得光密度值。

五、注意事项:
1、每次测量前检查,检查波长是否所需值;
2、比色皿应拿磨砂面,不可用手接触透光面;
3、比色皿在盛装样品前,应用所盛样品冲洗两次,装样量为比色皿的2/3容积;
4、向比色皿加样时,若样品流到比色皿外壁时,应用滤纸点干,切忌用滤纸擦拭,以免比色皿出现划痕;
5、测量结束后应用蒸馏水清洗比色皿,清洗干净后放起.

六、数据处理。

试管
1
2
3
4
5
6
7
8
9
光密度值（nm）
0.025
0.132
0.186
0.297
0.324
0.077
0.082
0、71
0、73

y = 0.3557x - 0.0172

根据公式可以算得还原糖为0.27mg总糖为2.07mg.
则还原糖百分含量=毫克数×提取液总体积\测定时取用体积÷样品的质量=13.5%
总糖的百分含量=毫克数×稀释倍数÷样品质量×0.9=18.63%
总结：本实验测得还原糖的含量为13.5%，总糖含量为18.63%，R²为0.9739，实验数据还是略有偏差。

七、误差分析。
1、在配置制作葡萄糖标准曲线的溶液时，使用移液管移动液体，由于不够熟练，所以并没有准确移动相应的液体量，导致R²偏低。
2在提取还原糖时，由于我们采用的是最简单的棉花过滤方法，这个方法可能导致有许多还原糖被浪费，导致所测还原糖含量偏低。
此外，我们也需要注意，在标准的实验中，标准曲线的制定与样品含糖量必须同时进行，一起显色和比色。

八、体会。
这次试验我们学习了植物总糖、还原糖的提取鉴定及其含量测定，掌握了还原糖和总糖测定的基本原理，同时也对比色法测定还原糖有了一定了解并且还掌握了使用分光光度计测定还原糖和总糖的光密度值收获许多，试验中要求每只试管同时进行水浴加热加热时间视实验原料而定，严格控制时间。
分光光度计是溶液中的物质在光的照射下产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。我们就利用了这个原理，测定了还原糖和总糖的含量，而且绘制了葡萄糖标准曲线。
实验很有意思，接触新的仪器也让我很开心，希望以后也会这么愉快。

九、参考文献
吴兰老师PPT
《生物化学实验》 第三版
百度文库

十、感谢
吴兰老师指导
同组成员：朱帅、周洁、曹冲