阿尔茨海默症动物模型.ppt

阿尔茨海默症动物模型 阿尔茨海默病（AlzheimerS disease,AD）是一个起病隐匿进行性发展神经系统退行性疾病。关键表现为进行性认知功效障碍、记忆力减退、运动行为失常和人格改变等;其关键组织病理学特征是神经元胞外出现淀粉样蛋白（A）聚集形成神经炎性斑NPs,亦称老年斑（SPs）、胞内tau蛋白异常磷酸化形成神经原纤维缠结（NFTs）、神经元凋亡或缺失、突触缺失等。伴随中国多年来人口老龄化越来越严峻,AD发病率显著提升,在阿尔茨海默病相关研究中,建立理想动物模型颇受关注,这有利于促进阿尔茨海默病病因、发病机制、病理过程,以及寻求和筛选预防与诊疗药品等研究深入。背背景景AD模型大鼠研究方案模型大鼠研究方案目目录CATALOGAD动物模型学物模型学习评价价AD动物模型研究物模型研究进展展AD动物模型研究物模型研究进展展01代 很多动物都能够成为模拟阿尔茨海默病病理学特征模型,包含鼠、猫、犬、兔、山羊、绵羊、北极 熊和非人类灵长类动物等。其中,小鼠和大鼠相对于其她动物价格廉价、繁殖力强、生存率高、易喂养,有利于进行大样本试验研究,而且含有较强快速学习能力,生理过程靠近人类,所以小鼠和大鼠是现在最广泛用于制备阿尔茨海默病模型动物。试验动试验动物物物物选择选择 01 自然衰老的自然衰老的动物模型物模型 快速老化小鼠模型以衰老以衰老为基基础的的AD模型模型03 APP 转基因模型基因模型 PS1 转基因模型基因模型tau 相关模型相关模型 多重多重转基因模型基因模型 转基因基因AD模型模型02化学化学损伤物理物理损伤饮食食诱导 各种因素各种因素诱发的的AD模型中国外中国外中国外中国外ADADADAD动动物模型研究物模型研究物模型研究物模型研究进进展展展展 AD 是一个与年纪亲密相关疾病,衰老原因在AD 发病过程中起着关键作用。以衰老为 AD 发病基础动物模型成为试验研究中不可或缺部分 自然衰老自然衰老AD模型模型自然衰老自然衰老动物模型物模型脑内神内神经元萎元萎缩，胆碱能功能低下，同，胆碱能功能低下，同时表表现为感感觉、运、运动以以及学及学习记忆力等多种功能的减退，力等多种功能的减退，这符合符合 AD 患者的患者的临床表床表现。造模方法：将造模方法：将12月月龄小鼠或小鼠或35月月龄大鼠，雌性或雄性，大鼠，雌性或雄性，饲养在屏障养在屏障环境的境的动物物实验室，直至室，直至饲养所需的年养所需的年龄。常用老年。常用老年动物的年物的年龄为小鼠小鼠1224月月龄，大鼠衰，大鼠衰老早期老早期2126 月月龄，衰老晚期，衰老晚期 3032 月月龄。此模型的此模型的优点：点：动物物脑内的神内的神经递质及形及形态学改学改变是自然是自然发生的，与生的，与 AD 真真实的的病理生理改病理生理改变更更为接近，不需要人接近，不需要人为损伤、干、干预。缺点：只是模缺点：只是模拟了部分与人了部分与人类正常衰老相关的神正常衰老相关的神经改改变，缺乏，缺乏 AD 相关相关 A沉沉积及及 NFT，并不能全面模并不能全面模拟 AD 的的变化。且化。且动物物饲养周期和养周期和实验周期周期长、病死率高。、病死率高。以衰老以衰老以衰老以衰老为为基基基基础础ADADADAD模型模型模型模型快速老化小鼠模型快速老化小鼠模型 1975年日本京都大学年日本京都大学Take-da 教授培养出快速老化小鼠（教授培养出快速老化小鼠（senescence accelerated mouse/prone，SAMP）。此后，根据小鼠衰老程度、寿命和病。此后，根据小鼠衰老程度、寿命和病理表理表现进行行选择性繁殖，其中性繁殖，其中 SAMP8 作作为 AD 动物模型被广泛物模型被广泛认可。可。此模型此模型优点：点：SAMP8 既有自然衰老小鼠特征，又有既有自然衰老小鼠特征，又有类似似 AD 脑部病理改部病理改变及及学学习记忆障碍，已被广泛障碍，已被广泛应用于研究与年用于研究与年龄相关的学相关的学习记忆障碍的机制及相关的障碍的机制及相关的药物研物研发中中 缺点：缺点：该模型成本模型成本较高，小鼠寿命短，不适合用于高，小鼠寿命短，不适合用于长周期周期实验。以衰老以衰老以衰老以衰老为为基基基基础础ADADADAD模型模型模型模型010203 A注射注射诱导模型模型东莨菪碱莨菪碱诱导的模型的模型侧脑室注射室注射链脲菌素菌素诱导模型模型 化学化学高脂高脂饮食食诱导模型模型硫胺素缺乏硫胺素缺乏诱导模型模型饮食食多种原因多种原因多种原因多种原因诱发动诱发动物模型物模型物模型物模型物理物理 剥夺动物供氧模型 A注射注射诱导模型模型 脑内内A代代谢产物物的的沉沉积是是 AD 发病病机机制制中中最最重重要要的的一一点点。A的的沉沉积可可引引起起神神经元元的的局局灶灶性性坏坏死死、神神经元元缺缺失失和和神神经胶胶质细胞胞增增生生，最最终引引起起相相应的的胆胆碱碱能能神神经元元功功能能的的丧失失和和学学习记忆减退的减退的损害。害。造造模模方方法法：大大多多数数是是通通过注注射射A到到实验动物物海海马区区来来实现，剂量量范范围在在510g 之之间，体体积多多为5L。方方法法有有单侧海海马内内注注射射、双双侧海海马内内注注射射等等，注注射射后后应留留针 10 min，以以保保证溶液充分弥散。溶液充分弥散。此此模模型型的的优点点：动物物脑内内的的神神经递质及及形形态学学改改变是是自自然然发生生的的，与与 AD 真真实的的病病理理生生理改理改变更更为接近，不需要人接近，不需要人为损伤、干、干预。缺缺点点：只只是是模模拟了了部部分分与与人人类正正常常衰衰老老相相关关的的神神经改改变，缺缺乏乏 AD 相相关关 A沉沉积及及 NFT，并不能全面模并不能全面模拟 AD 的的变化。且化。且动物物饲养周期和养周期和实验周期周期长、病死率高。、病死率高。化学化学化学化学损伤损伤致致致致 AD AD 模型模型模型模型 东莨菪碱莨菪碱诱导的模型的模型 乙乙酰胆胆碱碱（acetylcholine，ACh）是是一一种种重重要要的的中中枢枢神神经递质，在在学学习、记忆方方面面起起着着非非常常重重要要的的作作用用。AD患患者者基基底底前前脑胆胆碱碱能能神神经元元大大量量损伤或或死死亡亡、突突触触前前乙乙酰胆胆碱碱的的合合成成、Ch AT的的活活性性及及对胆胆碱碱的的摄取取能能力力都都明明显下下降降。这些些变化化的的程程度度与与患患者者认知知功功能能损害的程度呈正相关。害的程度呈正相关。造造模模方方法法：东莨莨菪菪碱碱为M胆胆碱碱受受体体阻阻断断剂，3mgkg-1东莨莨菪菪碱碱腹腹腔腔注注射射60d，可可阻阻断断小小鼠鼠大大脑皮皮层中中乙乙酰胆胆碱碱受受体体的的结合合位位点点，小小鼠鼠出出现胆胆碱碱能能神神经系系统障障碍碍的的一系列行一系列行为学改学改变，如，如记忆力下降、力下降、认知障碍等。知障碍等。此此模模型型的的优点点：简便便易易行行、不不需需手手术、费用用较低低，是是应用用广广泛泛的的 AD 模模型型建建立立方方法之一，主要用于考察胆碱能系法之一，主要用于考察胆碱能系统与与 AD 的关系及相关的关系及相关药物物临床前床前评价。价。缺缺点点：只只模模拟了了胆胆碱碱能能功功能能减减退退的的特特征征，缺缺乏乏 AD 典典型型病病理理特特征征，如如神神经元元变性性、A沉沉积等。等。化学化学化学化学损伤损伤致致致致 AD AD 模型模型模型模型 侧脑室注射室注射链脲菌素菌素诱导模型模型 链脲菌菌素素（streptozotocin，STZ）是是一一种种烷基基化化物物，腹腹腔腔注注射射可可通通过破破坏坏胰胰腺腺细胞胞引引起起糖糖尿尿病病。1998年年 Lannert和和他他的的同同事事首首次次建建立立侧脑室室注注射射 STZ 动物物模模型型，动物物出出现类似似 AD 的的记忆障碍。障碍。方方法法：将将大大鼠鼠固固定定于于脑立立体体定定位位仪上上，在在前前卤后后 1.5 mm，矢矢状状缝侧方方 1.5 mm处钻孔孔，微微量量进样器器注注射射 STZ 3 mgkg-1，于于手手术的的第第 1天天和和第第 3 天天分分别二二次次向向侧脑室室注注射射。小小剂量量 STZ 侧脑室注射可以制室注射可以制备痴呆模型。痴呆模型。此模型此模型优点：模点：模拟了散了散发性老年痴呆病的性老年痴呆病的许多重要的特点。多重要的特点。缺点：造模缺点：造模过程中程中动物的死亡率物的死亡率较高。高。化学化学化学化学损伤损伤致致致致 ADAD 模型模型模型模型冈田酸田酸诱导的的损伤模型模型 tau 蛋蛋白白过度度磷磷酸酸化化是是引引起起AD病病理理改改变的的重重要要机机制制。调节tau去去磷磷酸酸化化的的蛋蛋白白磷磷酸酸酶主主要要有有蛋蛋白白磷磷酸酸酶-2A（PP2A）、PP2B、PP2C 和和PP1冈田田酸酸（OA）是是一一种种海海洋洋生生物物提提取取物物，对 PP2A和和 PP1 有有 选 择 性性 抑抑 制制 作作 用。用。方方法法：大大鼠鼠侧脑室室注注射射OA0.4mmolL1，1.5 L，可可引引起起神神经细胞胞的的变性性、坏坏死死，同同时促促进脑内异常磷酸化内异常磷酸化tau蛋白的形成，蛋白的形成，还能造成能造成 A聚聚积，产生生类似似 AD 样病理特征。病理特征。兴奋性毒素性毒素损伤模型模型 在在AD患者中，患者中，兴奋性毒素性毒素过度刺激谷氨酸受体度刺激谷氨酸受体导致神致神经元死亡。元死亡。造造模模方方法法：将将溶溶于于人人工工脑脊脊液液的的IBO注注入入大大鼠鼠Meynert基基底底核核（nucleus basalis of meynert，NBM），每每只只 10 g，通通过损毁大大鼠鼠单侧NBM来来建建立立AD模模型型，动物物表表现出出明明显的学的学习记忆障碍。障碍。秋水仙碱秋水仙碱诱导模型模型以化学以化学以化学以化学为为基基基基础础ADADADAD模型模型模型模型 秋水仙碱可秋水仙碱可选择性破坏海性破坏海马神神经元元,破坏胆碱能神破坏胆碱能神经通路通路,使使动物出物出现短期学短期学习记忆障碍。障碍。方方法法:侧脑室室注注射射秋秋水水仙仙碱碱（大大鼠鼠 15g、小小鼠鼠2.8g）可可造造成成动物物在在2 周周后后出出现显著著学学习记忆障碍。障碍。重金属重金属诱导模型模型 AD脑组织内内铝的的含含量量明明显高高于于正正常常人人，高高浓度度铝对神神经系系统有有毒毒害害作作用用，促促进大大脑内内 NFT 和和 A聚集，使神聚集，使神经元元变性或死亡，表性或死亡，表现为大大脑皮皮质萎萎缩，出，出现记忆，认知功能障碍。知功能障碍。方方法法：利利用用这一一机机制制，小小鼠鼠侧脑室室注注射射0.5%Al Cl3 2 L，每每天天 1 次次，连续 5 d，末末次次注注射射 15 d 后后，小小鼠鼠表表现出出明明显的的空空间学学习障障碍碍。此此外外小小鼠鼠连续腹腹腔腔注注射射 Al Cl3 100 mgkg-1，周期，周期 50 d，隔日，隔日 1 次，也可造成次，也可造成记忆损伤模型。模型。叠氮叠氮钠诱导模型模型 有有研研究究表表明明，AD 患患者者线粒粒体体功功能能存存在在明明显异异常常。叠叠氮氮钠（Na N3）通通过抑抑制制线粒粒体体呼呼吸吸链，产生自由基，抑制能量代生自由基，抑制能量代谢，造成，造成线粒体粒体损伤，导 致致 一一 系系 列列 类 似似 AD 的病的病 理理 改改 变。方方法法：大大鼠鼠皮皮下下长期期给予予Na N33mgkg-1，2h皮皮下下间断断注注射射，每每天天8次次，连续注注射射4周周，可可诱导A沉沉积，出，出现类似似AD的的认知障碍。知障碍。谷氨酸谷氨酸损伤模型模型以化学以化学以化学以化学为为基基基基础础ADADADAD模型模型模型模型 过量量谷谷氨氨酸酸可可产生生严重重神神经兴奋毒毒性性,造造成成神神经元元损伤或或死死亡亡,与与AD 发生生、发展展有有亲密密关关系。系。方方法法:利利用用新新生生乳乳鼠鼠血血脑屏屏障障功功效效不不全全,外外周周注注射射谷谷氨氨酸酸25mgkg-1,40d 后后小小鼠鼠肥肥胖胖,基基底前底前脑多多处神神经元元变性性,脑内内 APP 免疫阳性改免疫阳性改变,细胞胞间隙隙 A大量沉大量沉积。慢性缺氧慢性缺氧动物模型物模型 AD 模模型型研研究究发现 AD 患患者者处于于长期期慢慢性性缺缺氧氧的的状状态。通通过剥剥夺啮齿类动物物的的供供氧氧，可可诱导与老化与老化脑功能相似的能量代功能相似的能量代谢障碍。障碍。方方法法：研研究究提提示示动物物经由由双双侧颈总动脉脉结扎扎致致全全脑缺缺血血12 min，后后复复灌灌24 h，会会引引起起行行为学上的障碍，并且学上的障碍，并且脑组织出出现与与AD患者相似的病理特征。患者相似的病理特征。该模模型型的的缺缺点点：可可以以模模拟AD的的临床床症症状状，但但缺缺乏乏AD特特异异性性胆胆碱碱神神经损伤以以及及A沉沉积。且且由由于于创伤较大大，不不相相关关的的干干扰因因素素过多多，易易引引起起脑内内其其他他部部位位的的损伤及及造造模模动物物的的死死亡亡。因此，因此，该模型成功率低，模型成功率低，现在已很少使用。在已很少使用。物理物理物理物理损伤损伤致致致致ADAD模型模型模型模型 高脂高脂饮食食诱导模型模型 有有报道道指指出出动物物给予予高高脂脂饲料料饲养养可可降降低低大大脑对葡葡萄萄糖糖的的摄取取，诱导动物物模模型型产生生糖糖耐耐量量降降低低及及胰胰岛素素抵抗，亦可抵抗，亦可损伤神神经元胰元胰岛素受体功能，引起素受体功能，引起tau 蛋白蛋白过度磷酸化，从而度磷酸化，从而导致致 NFT。方法：大鼠方法：大鼠给予高脂予高脂饮食食 2 个月后，即出个月后，即出现胰胰岛素抵抗，表素抵抗，表现出明出明显的空的空间学学习记忆障碍。障碍。该模型可以模模型可以模拟 AD 的一些病理特征，例如的一些病理特征，例如认知障碍及知障碍及 tau 蛋白蛋白过度磷酸化，主要的缺点是造模度磷酸化，主要的缺点是造模时间较长。饮饮食食食食诱导诱导ADAD 模型模型模型模型 硫硫胺胺素素缺缺乏乏（thiaminethiaminedeficiency,deficiency,TDTD）诱导能能量量代代谢下下降降、糖糖代代谢异异常常、氧氧化化应激激损伤、胶胶质细胞胞激激活、活、选择性神性神经元元丢失以及失以及认知功效知功效损害害,与与ADAD病理生理病理生理过程极程极为相同。相同。方方法法:8 8周周龄C57C57小小鼠鼠,经过给予予硫硫胺胺素素剥剥夺饮食食结合合腹腹腔腔注注射射硫硫胺胺素素焦焦磷磷酸酸激激酶抑抑制制剂 吡吡啶硫硫胺胺制制作作硫硫胺胺素素缺缺乏乏模模型型,造造模模13d13d后后取取脑,模模型型组小小鼠鼠内内侧丘丘脑出出现经典典对称称性性针尖尖样出出血血,小小鼠鼠皮皮质、海海马及及丘丘脑均出均出现AA沉沉积,tau,tau蛋白磷酸化。蛋白磷酸化。TDTD可引可引发AA沉沉积、tautau蛋白磷酸化增加等蛋白磷酸化增加等ADAD特征性病理改特征性病理改变。硫胺素缺乏硫胺素缺乏诱导模型模型转基因模型是研究 AD 发病机制及相关药品研发较理想工具,同时也成为了多年研究热点。APP 转基因模型基因模型 APP正正常常情情况况下下代代谢多多经过-分分泌泌酶和和-分分泌泌酶。基基因因突突变时，激激活活了了-分分泌泌酶和和-分分泌泌酶，导致致A增增多多，尤尤其其是是A42。A聚聚集集可形成具有神可形成具有神经毒性的原毒性的原纤维，进而形成而形成SP，加重，加重AD的的发展。展。方方法法：将将突突变APP基基因因（Val717-Phe）与与血血小小板板衍衍生生因因子子（platelet derived growth factor，PDGF）相相结合合形形成成PDAPP基因，基因，导入到小鼠体内，入到小鼠体内，获得PDAPP小鼠。小鼠。转转基因基因基因基因ADAD模型模型模型模型 位于12号染色体上早老素1(PS1)基因,及位于1号染色体上早老素 2(PS2)基因发生突变与家族性AD发病有着亲密关系。PS1M146V小鼠是比较经典转PS1基因动物。Catado等利用血小板源性生长因子2开启子促进神经元表示,构建了多个过分表示突变型 PS1 转基因鼠,发觉可造成选择性增加 A42。PS1 转基因模型 优点:APP 转基因小鼠及APP/PS-1双转基因小鼠是现在国际最为认可AD动物模型,其病理改变出现较早且显著,模拟了 AD 患者脑内 A增多、SP 形成。缺点:模型小鼠脑内产生 A与 AD 患者脑内 A存在生化组成差异,而且这些小鼠脑内没有发tau 蛋白磷酸化及 NFT,也没有表现出 AD 患者特有海马及皮层神经元丢失。这也是多数转基因小鼠模型缺点。转基因模型是研究 AD 发病机制及相关药品研发较理想工具,同时也成为了多年研究热点。神神经元元纤维缠结、tau 相关模型相关模型 AD 患者大脑皮质及海马区出现NFT的主要原因是tau蛋白的过度磷酸化。因此认为tau基因突变将直接影响tau蛋白的结构和功能，引发神经系统疾病，可能是诱发 AD 的因素之一。JNPL3小小鼠鼠是是将将人人类FTDP-17突突变tau基基因因导入入B6D2（F1）小小鼠鼠，然然后后将将其其下下一一代代小小鼠鼠与与 C57BL/6回交而回交而获得。得。转转基因基因基因基因ADAD模型模型模型模型 AD 发发病病过过程程复复杂杂,与与脑脑内内多多个个基基因因调调控控失失调调有有着着亲亲密密联联络络,多多个个转转基基因因组组合合方方法法能能够够非非常常成成功功模模拟拟AD 病理改病理改变变和行和行为为学改学改变变特征特征,是是较为较为理想理想 AD 动动物模型。物模型。双双转转基基因因小小鼠鼠Tg2576/tau P301L小小鼠鼠是是由由 Tg2576 小小鼠鼠和和tau P301L（JNPL3）小小鼠鼠杂杂交交而而来来,其其行行为为学学发发病病方方法法及及出出现现时时间间和和JNPL3 相相同同,A沉沉积积同同 Tg2576小小与与表表示示人人基基因因组组MAPT 基基因小鼠因小鼠杂杂交取得。此模型已交取得。此模型已经经成成为为研究研究 NFT 病理特征及相关病理特征及相关tau 蛋白生化有力工具。蛋白生化有力工具。多重多重转基因模型基因模型 转基因果基因果蝇模型模型 研研究究表表明明，在在已已知知的的人人类疾疾病病致致病病基基因因中中，果果蝇具具有有约75%的的同同源源基基因因，包包括括AD所所涉涉及及的的 Appl，Pen-2，Nicastrin，tau以以及及GSK-3等等基基因因。除除了了具具有有大大量量的的同同源源基基因因外外，果果蝇的的神神经退退行行性性疾疾病病模模型型与与人人类神神经退退行行性性疾疾病病还有有许多多相相似似的的表表型型，如如迟发性性、进程程性性和和神神经系系统的的高高毒毒性。因此，果性。因此，果蝇为研究研究 AD 发病机制以及病机制以及进行治行治疗药物的物的筛选和和验证提供了另一种模式生物方法。提供了另一种模式生物方法。常常用用的的转基基因因果果蝇模模型型主主要要有有APP转基基因因模模型型、BACE转基基因因模模型型、A转基基因因模模型型、tau蛋蛋白白转基因模型、双重或多重基因模型、双重或多重转基因模型等。基因模型等。优点点：果果蝇因因其其基基因因背背景景清清晰晰、生生命命周周期期短短暂、与与年年龄相相关关的的神神经元元退退化化明明显、繁繁殖殖迅迅速速以以及及易易于于培培养养观察察等等特特点点在在 AD 模模型型中中具具有有独独特特优势。另另一一方方面面，可可以以用用果果蝇模模型型直直接接对已已有有的的大大量量药物物进行行筛选，以期，以期获得改善疾病症状的得改善疾病症状的药物，加快哺乳物，加快哺乳动物乃至人物乃至人类的的药物物实验。缺点：是其缺点：是其肠胃酸碱度以及吸收食物的途径与哺乳胃酸碱度以及吸收食物的途径与哺乳动物差物差别较大。大。转转基因基因基因基因ADAD模型模型模型模型AD动物模型学物模型学习评价价02年度工作概述年度工作概述年度工作概述年度工作概述年度工作概述学学学学习评习评价价价价 上述 AD 动物模型各有其优缺点,多数仅能部分模拟 AD 病理学特征及临床症状,尚无一个公认最理想模型。即使是现在最为广泛使用并认可多重转基因动物,也有待于深入完善。理想 AD 动物模型应含有以下 3 个方面特征:含有 AD 关键神经病理学特征SP 和NFT;出现大脑神经元死亡、突触丢失和反应性胶质细胞增生等 AD 关键病理改变;出现认知和记忆能障碍。AD模型大鼠的研究方案模型大鼠的研究方案03增殖增殖细胞胞标记动物物处理理检测指指标 研究目研究目标、研究内容、研究内容动物模型制物模型制备、分、分组给药干干预措施措施 010203060504ADAD模型大鼠研究方案模型大鼠研究方案模型大鼠研究方案模型大鼠研究方案1 2明确毛冬青甲素影响阿明确毛冬青甲素影响阿尔茨海默大鼠茨海默大鼠脑海海马组织神神经元再生作用。元再生作用。从从BDNFBDNF表示水平影响揭示毛冬青甲素促表示水平影响揭示毛冬青甲素促进神神经元再生作用机制元再生作用机制,为中中医医药防治阿防治阿尔茨海默病提供茨海默病提供试验依据和作用靶点。依据和作用靶点。研究目研究目研究目研究目标标12检测毛毛冬冬青青甲甲素素对阿阿尔茨茨海海默默模模型型大大鼠鼠海海马神神经元元再再生生影影响响,经过AA海海马注注射射大大鼠鼠模模型型,采采取取尼尼式式染染色色法法观察察、BrduBrdu标识增增殖殖细胞胞,用用ImageImageProProPlusPlus6.06.0图像像处理理系系统进行行细胞胞计数。数。研究内容研究内容研究内容研究内容检测毛毛冬冬青青甲甲素素对阿阿尔茨茨海海默默模模型型大大鼠鼠海海马神神经元元BDNFBDNF水水平平影影响响,采采取取免免疫疫组化化法法检测海海马组织中中BDNFBDNF表表示示,采采取取分分子探子探针检测BDNFmRNABDNFmRNA表示情况。表示情况。药物物毛冬青甲素毛冬青甲素 购于广于广东省博省博罗先先锋药业集集团有限公司有限公司实验动物物SD大鼠36只，清洁级，180-220g，雌雄各半。湖南中医药大学SPF级动物实验中心提供动动物模型制物模型制物模型制物模型制备备及分及分及分及分组给药组给药 大鼠适应性喂养一周后,参考相关文件选择 A海马注射大鼠模型,将SD大鼠用 10%水合氯醛按4 m Lkg-1剂量行腹膜麻醉后,固定于脑立体定位仪上,备皮,消毒,沿颅顶中线做1-2cm切口,分离骨膜,找到前囱位置,参考大鼠脑立体定位图谱,确定前囟后3.0 mm,中线旁2.0 mm为海马CA1所在部位体表投影位置,以牙科钻钻开一骨窗,微量注射器固定于立体定位仪上,自脑表面垂直进针约2.8mm,假手术组脑内注射等体积生理盐水;其它各组两侧海马各缓慢均匀注入1lA25-35,5 min注射完成,留针5min,然后缓慢撤针,缝合皮肤并涂红霉素软膏,肌注青霉素,预防感染。清醒后放回笼中常规喂养。动物造模物造模模型模型评价价在造模第在造模第20天，天，对所有大鼠称重，并所有大鼠称重，并进行蔗糖水消耗行蔗糖水消耗实验和和Morrsi水迷水迷宫实验，最后根据最后根据实验结果果评定大鼠是否造模成功。定大鼠是否造模成功。动物分物分组对造模成功的大鼠随机分成3组，每组12只，分别为假手术组、模型组、毛冬青甲素组。动动物模型制物模型制物模型制物模型制备备及分及分及分及分组给药组给药010203 于造模后第3d起开始用药，毛冬青甲素组舌下静脉注射30mgkgd-1，每天两次，连续给药4周。毛冬青毛冬青组无干预措施假手假手术组干干干干预预方法方法方法方法模型模型组无干预方法增殖增殖细胞胞标记 给药25天后，每组取6只，雌雄各半，将Brdu按照50mg/kg 的剂量，10mg/ml 浓度溶于生理盐水，腹腔注射2次/天，每次间隔2h，其中最后一次在处死前24h注射。动物物处理理 在给药后的第28天，将大鼠用10%水合氯醛按4mLkg-1的剂量腹膜麻醉。麻醉成功后，取仰卧位固定四肢。剖开胸腹充分暴露心脏与肝脏，剪开左侧心尖部，剪开右心耳，插导管于左心室并固定，穿刺针经左心室穿刺至升主动脉，快速灌注生理盐水至肝脏完全变白，右心耳流出完全清亮液体后，予4%的多聚甲醛液灌注先快后慢，见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意。然后将注射了Brdu的大鼠开颅完整取出鼠脑，保留海马部位，切去多余部分，经后固定 48 h后常规石蜡包埋。其余大鼠断头取脑，取出海马组织，投入液氮保存。海海马组织细胞形胞形态结构构观察察采用采用Nissl染色法染色法进行行观察察海海马增殖增殖细胞胞检测免疫组织化学检测Brdu标记的增殖细胞检测检测指指指指标标 采取免疫组化法检测海马组织中BDNF表示,采取分子探针检测BDNF mRNA表示情况。脑源性神源性神经营养因子养因子检测THANKSFORWATCHING!THANKSFORWATCHING!谢谢观看看