微生物生理学教学文稿.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,微生物生理学,Add your company slogan,微生物生理学,徐诚蛟,绪 论,1,2,微生物的细胞化学和结构,微生物的营养,3,4,微生物代谢概论,微生物的产能代谢,5,6,微生物的合成代谢,微生物的次级代谢,7,8,微生物的代谢调节,微生物的生长、繁殖与环境,9,10,微生物的分化与发育,目录,2,第,1,章 绪 论,厨房抹布（含有细菌、真菌菌丝和酵母菌）,4,微生物生理学是微生物学的一个主要分支学科，是一门,研究在实验室和自然条件下微生物生理活动特点与规律的学科。,研究对象：微生物生命活动规律以及和周围环境之间的关系,。,研究范围：微生物细胞的重建方式与一般规律。,微生物与周围环境之间的关系。,微生物生理活动与人类的关系,。,1.1,微生物生理学研究对象与范围,5,微生物生理学建立于,19,世纪中后期。尽管古代人民在和疾病作斗争、食品酿造和农业生产过程中，不自觉地利用了微生物，但由于它们形体小，肉眼难见，人们并不知道疾病、酿造和土壤中的物质转化是微生物活动的结果。,1.2,微生物生理学的发展,6,荷兰的吕文虎克才打开了微生物界的大门,1676,年,7,19,世纪中后期,巴斯德、柯赫、维诺格拉德斯基和贝格林克,等先驱者们的卓越工作，为微生物生理学奠定了坚实的科学基础。,路易斯,巴斯德,（,1822-1895,）,8,巴斯德,打破了微生物自然发生说,。,免疫学,和,微生物发酵,的研究等万面都有伟大的贡献，并揭露出在自然界存在有能在,无氧条件,下进行生活的微生物 ，他对,酒,“,病,”,和蚕病,的研究，挽救了当时法国的酿酒业和蚕丝业。他发明的,巴斯德灭菌法，,一直沿用至今。,9,柯赫,是与巴斯德同时代的一位德国乡村医生。他首先证明动物炭疽病的病原是细菌，并发明了,分离和培养纯菌的方法,。,他提出的著名的,证病律,，至今仍指导着动、植物病原的确定。,罗伯特,柯赫,(1843-1910),10,微生物生理学进一步的发展应归功于俄国的微生物学家,维诺格拉德斯基,和荷兰的微生物学家,贝格林克,。,维诺格拉德斯基发现了微生物的,自养生活,硫细菌氧化,H,2,S,获得能量,利用,CO,2,作为碳源而生长,化能无机营养型的细菌生活方式。,其后他又研究了铁细菌和硝化细菌，再次揭示和确定了这类自养细菌的特性。,11,贝格林克利用,加富培养,的方法，,首先,自土壤中分离出,能固定空气中氮素的,好氧固氮菌和蓝细菌,（过去称为蓝绿藻）。,其后，他又成功地,自豆科植物根瘤中分离出根瘤菌,（,1888,）。,维诺格拉德斯基和贝格林克的开创性的工作，不仅推动了微生物生理学的发展，也为土壤微生物学莫定了墓础。,12,微生物生理学发展的,一个重要转折点,是,德国布赫纳（,Buchner,）发现了酵母菌的无细胞制剂可将蔗糖转化成酒精。,从此微生物生理学的研究进入了分子水平，并,诞生了生物化学,。此后，这两个学科紧密结合，共同发展。自,1900,1960,之间，许多重要的代谢途径，都是首先利用,微生物作为研究,对象而被阐明，然后在高等生物中得到证实。,1676,年,1864,年,1897,年,微生物学,微生物生理学,生物化学,13,自,60,年代之后，由于,雅可布和莫纳德,研究诱导酶形成机制而建立的,操纵子学说,(1961),，则标志着微生物生理学朝向代谢调控研究的兴起，并进一步将微生物生理学、生物化学和遗传学结合在一起，形成了分子生物学。,早在,40,年代，由于脉孢霉的遗传研究，提出了基因控制酶的学说，促使遗传学由形式遗传学进入生化遗传学阶段。,14,1944.,细菌的转化作用和转化物质的提纯等，第一次确定了,DNA,是遗传的物质基础。,1947.,细菌重组。,1949.,噬菌体重组。,1952.,细菌转导的相继发现。,1953.Watson,和,Crick.,DNA,分子双螺旋结构的建立。,1955.,基因细微结构的分析。,1958.DNA,复制机制。,1964.DNA,和,RNA,的分子杂交等重要成就，为建立分子遗传学打下了坚实的基础。,15,1961.,遗传密码的破译和蛋白质生物合成机制的阐明,，是继发现,DNA,作为遗传物质之后，生物科学上最重要的一项成就。,由于分子遗传学的迅速发展使得人们有可能利用分子遗传学的技术，有目的地改造旧物种和创造新生物，这是当今兴起的一项崭新的,DNA,重组技术。,16,抗生素,已成为现代化的大企业生产；,微生物酶制剂,已广泛用于农、工、医；,微生物的其他产物,，如有机酸、氨基酸、维生素等都在进行大量生产。,在本世纪,40,年代后，微生物的应用有了重大的发展。,17,1.3.1,生物化学方面,初级代谢的调节、次级代谢产物合成 途径与次级代谢的调节、能量转换的基础；,集中研究一些特殊类型生物的生理活动,纤维素分解菌 产甲烷细菌 石油分解菌,有机农药分解菌 单细胞蛋白产生菌等,人工合成大分子物质分解菌、共生菌、寄生菌等,1.3,微生物生理活动的研究,18,1.3.2,生物大分子结构与功能的研究,1)阐明微生物遗传信息传递与表达的方式和规律；研究膜结构与功能;,2)继续发现与研究新的细胞结构与功能；,3)研究极端环境条件下微生物抗性与敏感性的机理及其调节，从分子水平上阐明生命的本质。,19,1.3.3,细胞的重建、形态发生、分化过程与趋向性,1)重点是研究微生物组建成一个完整的有生物活,性细胞结构过程；,2)研究微生物形态发生与分化的分子机理；,3)研究微生物的趋向性（趋化性、趋光性、趋磁,性等）与运动的本质和生命与环境之间的本质,联系等。,20,微生物的生产已构成了一项庞大的,发酵工业,。为了有效地进行微生物的生产，需要掌握微生物生理学的知识和技术。,20,世纪,80,年代是生命科学兴起的时代，今后微生物生理学必将有更广泛而深入的发展，有待于善于思考和勤于工作的研究者们去开发。,21,总 结,第,1,章 绪 论,1.1,微生物生理学研究对象与范围,1.2,微生物生理学的发展,1.3,微生物生理学研究内容,22,第,2,章 微生物的细胞化学和结构,微生物界是一大群微小的生物，其中包括非细胞形态的,类病毒和病毒,，以及具有细胞结构的,细菌、真菌、藻类和原生动物,。类病毒和病毒结构简单，不能营独立生活，只有寄生在寄主的细胞内才能繁殖。,因此，通常认为,细胞是组成生命的基本单位，能独立生长和繁殖，是一个高度有组织的生命系统。,24,根据细胞中贮存的遗传信息的结构，通常将生物分成为两大类型,：,原核生物和真核生物。,原核生物细胞中的遗传信息虽然和真核生物的相同，都是贮存在,DNA,大分子中，但原核生物的,DNA,却不像真核生物那样为膜包围成为一个明确的细胞核。此外，原核生物细胞中也缺少由膜包围的其他细胞器（如线粒体和叶绿体）和沟通并协调细胞内部生命活动的内质网络。,近年来，用新发展核酸测序技术，分析了各类生物的,16SrRNA,序列，提出了被称为第三型生物的古细菌，与真细菌和真核生物并列。,25,细胞结构使得生命系统与周围环境分开，以,细胞质膜,作为渗诱屏障，控制着物质的流入和流出细胞。,26,细胞质膜外围的坚实的,细胞壁,则保护细胞免于遭受渗透冲击而导致的细胞崩解。原生动物和少数细菌的细胞没有细胞壁，但它们的,细胞质膜,另有加固机制。其他的细胞外部结构，如细菌的荚膜，也起保护作用。有些细胞的表面有运动器官，用以找到适合它们生活的环境和避开不利的环境。,27,此外，非细胞的、原核的和真核的生物结构差异的研究，也为应用微生物学提供了理论基础。各种抗生素防治人类、其它动物和植物的各种传染病的作用机制，就是在研究不同生物细胞的结构和功能的基础上发展起来的。,28,2.1.1,生物元素,组成细胞的化学元素，称为生物元素。,在自然界常见的,90,多种化学元素中，只有约,20,种元素参与生命活动，其中包括：,2.1,微生物细胞的化学组成,组成细胞的有机化合物和水,或以离子游离于细胞质中，或与有机酸化合成易被解离的盐类,组成各种酶的辅基，它们在细胞中的含量甚微，通常称为微量元素。,C,、,H,、,O,、,N,、,P,、,S,、,Na,、,K,、,Mg,、,Mn,、,Ca,、,CI,、,Fe,、,Zn,、,Cu,、,Co,、,Ni,、,Mo,、,Se,和,W,。,29,生物学元素表,30,2.1.2,研究方法,2.1.2.1,细胞鲜重测定,培养基中微生物过滤或离心收集菌体细胞洗净细胞表面培养基吸去细胞外水分称重得细胞的鲜重，以每升培养液中所含有的细胞鲜重（,g/L,）表示。,由于细胞在收集过程中会聚集成团，细胞与细胞之间的水分难以除去，因此，用上述方法所测得的细胞鲜重往往比实际的重量要,细胞之间的水可用加入同位素标记的蛋白质的方法，加以测量，因为蛋白质不能掺入细胞，只是溶于细胞外围的水中，测定细胞团的放射活性，可以推算出细胞外围的水量。,31,2.1.2.2,干重测定,将一定重量的鲜细胞，在,105,高温下，或在低温（,60,）真空下干燥至恒重，测出细胞干重，通常以,g/l,或,mg/ml,表示。,大肠杆菌在适合的培养条件下，每升培养液可产生,25-30g,干细胞。酵母菌可产生,40g,以上干细胞。近年来，采用高密度培养技术，可达到,120g/L,干酵母的产量。,32,2.1.2.3,含水量测定,含水量，以鲜重的百分率表示。,生活细胞中含有大量的水，约占鲜重的,70%,90%,。,一般单细胞微生物，如细菌和酵母菌的含水量（分别为,70%,80%,和,75%,85%,）较丝状真菌细胞的含水量（,85%,90%,）低。,休眠孢子的含水量都较低，细菌芽胞的含水量约为,40%,，曲霉的分生孢子的含水量只有,20%,，可见水和细饱的生理活性密切相关。,33,2.1.2.4,无机元素分析,分析细胞中各种元素的含量，不仅能反映原生质的化学组成，也涉及细胞中的贮存物质。后者的含量，常因微生物和培养条件的不同而有变化，分析结果往往不易重复。,C,碳的含量（测燃烧时所放出的二氧化碳量）在各种,微生物细胞中都比较恒定，大都占细胞干重的,50%,5%,。,34,N,通常所采用的,Kjedahl,（凯氏）定氮法，只能测出细胞中的氨态氮，测不出硝态氮或偶氮中的氮，也测不出嘌呤和嘧啶环中的氮。,氮在单细胞微生物中的含量（,8%,15%,）高于在丝状真菌细胞中的含量,(5%,）。,用同位素标记测定法比较精确，其测定值要比用,Kjedahl,法所测出的数值高。用同位素标记法测大肠杆菌的含氮量为,154mgN/g,（干细胞），即相当于细胞干重的,15.4%,。,35,H,和,O,氢和氧的含量由燃烧时所产生的水推算，,氢约占细胞干重的,10%,，氧占,20%,。,除上述的碳、氮、氢和氧四种元素外，其他矿质元素总共约占细胞干重的,3%,5%,，当将细菌细胞在,550,高温马福炉中焚化后，这些矿质元素以氧化物的形式残留于灰分中。,P,在灰分中，,磷的含量,最高，约占灰分的,50%,，相当于细胞干重的,3%,其中，,65%,磷存在于核酸中，,15%,存在于磷脂中，,20%,在于可溶的小分子有机化合物（主要是磷酸脂类）中。,36,S,硫,约占,大肠杆菌细胞,干重的,1%,，其中，,75%,半胱氨酸和蛋氨酸的形式存在于蛋自质中；其余的,25%,存在于酸溶部分中，,主要是谷胱甘肽和含硫的辅酶（如辅酶,A,，硫胺素焦磷酸、硫辛酸和生物素等）。,在硫细菌细胞中硫的含量往往甚高，有的硫细菌当氧化硫化氢时会在细胞中积累硫的颗粒。,37,在金属元素中，钠、钾、钙、镁和锰，或以离子游离于细胞中，或组成易被解离的有机盐类。,钠,的含量易随培养基中钠的浓度而波动。钠、钾与渗透调节有关。,镁和锰,是许多酶的激活剂，镁也是蓝细菌和光合细菌叶绿素的组成成分。,铁,通常结合在大分子中，如触酶和细胞色素血红素辅酶中含有铁，铁硫蛋白中也含有铁。此外，在铁细菌细胞外常沉积有大量的氢氧化铁。在硅藻的细胞壁中积累有大量的硅。,38,其他的生物元素在细胞中的含量则甚微，它们大多组成各种酶的辅基，如锌组成许多脱氢酶和核酸聚合酶的辅基，钼是固氮酶活性中的组成元素，硝酸还原酶中也含有钼，钴是维生素,B12,辅酶的成分，铜存在于细胞色素氧化酶中谷胱甘肽过氧化物酶中含有硒。,元素,占细胞干重,(%),C,50,O,20,N,14,H,8,P,3,S,1,K,1,Na,1,Ca,0.5,Mg,0.5,Fe,0.5,其它,0.3,表大肠杆菌细胞中主要元素大致含量,39,2.1.2.5,生物分子的分离,由各种生物元素所组成的细胞有机化合物称为生物分子，,以区别于非生物来源的有机化合物。,10,3,10,9,小分子,大分子,超分子,亚细胞结构,结合,装配,蛋白质,核酸,多糖,脂类,细胞壁,细胞质膜,细胞核,线粒体,叶绿体等,氨基酸,核苷酸,脂肪酸,甘油及,中间代谢产物,40,细胞中大量的蛋白质都是酶，它们或溶于细胞质中，或结合在膜上，催化着各种生化反应。有些多糖和脂类则以贮存物质颗粒存在于细胞中。,小分子的分子量在,500,以下，主要的是一些组成生物大分子的单体，如氨基酸、核苷酸、脂肪酸和甘油等，此外，还有代谢中间产物，如丙酮酸、柠像酸、苹果酸等有机酸，维生素以及各种次级代谢产物（如抗生素、毒素和色素等），它们或分泌于细胞外，或存留在细胞中。,41,通常采用,10%,三氯醋酸在低温（,0,4,）下浸提细胞，小分子可溶于冷三氯醋酸中，少于,20,个氨基酸的碱性肽和少于,20,个核苷酸的寡核苷酸也溶于冷三氯醋酸中。细胞中的小分子的含量不高，以大肠杆菌细胞为例，小分子约占细胞干重的,5%-6%,，生物大分子不溶于冷三氯醋酸。用有机溶剂可自酸不溶的部分中抽提出脂类。在大肠杆菌细胞中，脂类约占细胞干重的,10%-15%,。在芽孢杆菌和某些细菌的细胞中。常含有大量的多聚,B,羟基丁酸。在分枝杆菌属细胞中，含有特殊的蜡脂，其量可达细胞干重的,10%,。,用碱可自酸不溶的残渣中抽提出,RNA,，平均占细胞干重的,10%,。用热的稀三氯醋酸可抽提出,DNA,。余下的残渣仍含有蛋白质和多糖。用酚水抽提残渣，蛋白质溶于酚相，多糖溶于水相，但在酚一水界面仍含有一些蛋白质和多糖（肽聚塘）。,42,生物分子分离流程简图,细胞,上清液,(,小分子,),沉淀,(,大分子,),抽提液,(,脂类,),残渣,抽提液,(RNA),残渣,抽提液,(DNA),残渣,水相,(,多糖,),界面,(,蛋白、肽聚糖,),酚相,(,蛋白,),10%,三氯醋酸，,0,4,下浸提过液，,5000g,离心,10min,甲醇乙醚,(1:1),抽提,0.5mol/LNaOH,，,37,浸提,40min,，,冷却后，加冷三氯醋酸,5%,三氯醋酸，,80,抽提,30min,43,上节所述细胞化学组成的分析，只能说明细胞是由哪些物质组成的以及它们的大致含量，但不能提供细胞结构和功能的信息。,为了进一步了解是哪些物质组成了什么亚细胞结构以及这些亚细胞结构的生理功能，需要将细胞破碎，分离出各种不同的亚细胞结构后，再加以研究。,2.2,细胞结构研究方法,44,研磨法,研磨法是最简便的方法，不需要特殊设备。,1894,年,Buchner,就是用这种方法，将酵母菌细胞放在研钵中，经,研磨而将细胞破碎,的。,虽然这种方法破碎细胞的效率不高，至今,丝状真菌细胞,的破碎仍常采用此法，为了提高研磨的效率和避免研磨时产生热，可事先将菌丝体在,液氮中快速冷冻后,，,再加以研磨。,2.2.1,细胞破碎,45,压榨法,这种方法的原理是利用,高压破碎细胞。,French,压榨机，它的结钩是在一个耐高压的不锈钢筒，装配有可移动的密封活塞。钢筒下有一可调微孔的细管与外界相通。操作时，关闭微孔，风筒中加入浓细胞悬液，加高压使活塞下降，并保持最大压力。缓慢地打开微孔，当,细胞悬液通过微孔时，由于高压的强烈剪切力，致使细胞破碎，,流出收集备用。,46,为了避免高压产生热，在操作前可将压榨机预先冷却，并在冰浴中收集压榨液。,French,压榨机破碎,G,-,细菌和,G,+,杆菌的效果好，破碎,G,+,球菌和细菌芽孢的效果差。,X,压榨机,的结构与,French,压榨机的结构相似，不同的是它,压榨的,不是细胞悬液，,而是冻结的细胞。,细胞中的冰晶在高压下产生强烈的剪切力，使细胞破碎。因此，,X,压榨机需要在低温下（,-30,）操作，设备昂贵，但破碎效率高。对,G,和,G,+,细菌都有效。,47,弹道法,将细胞悬液与小玻璃珠混合后，装入,细胞振荡磨中，高速往返振荡,(2000-4000,次,/min),，在,3-5min,内就将细胞破碎，破碎效果好，价格比较便宜，也容易操作。为了降温，可在容器外围通入液体二氧化碳。,48,超声波法,超声波探头的高频振荡可造成溶液中形成,“,空穴,”,，即生成许多微小的气泡，,它们在探头附近高速运动,，产生强大的剪切力，足以破碎悬浮的细胞。,这种方法破碎的效率虽高，但缺点是在处理的过程中，所有的细胞不能同步破碎，有的先破了，有的后破。因此，先破的细胞仍继续遭受剪切力而形成更小的碎片。,49,而且在处理时会产生高温和泡沫，容易使蛋白变性和酶失活。为了降温需在冰浴中处理细胞悬液和采用不连续脉冲电源超声波发生器。操作时要注意保护耳朵，不要在塑料容器内处理细胞悬液，因为塑料器皿会吸收超声波的能量。,以上所介绍的四种方法，都是应用机械力量使细胞破碎。其中任何一种方法都不适用于所有的微生物。,破碎效率比较：,X-,压榨机振荡磨,French,压榨机超声波研磨。,各种微生物对破碎的抗性：酵母菌丝状真菌,G,+,球菌,G,+,杆菌,G,-,杆菌嗜盐菌支原体。,50,渗透冲击,这种方法是,在高渗溶液中将细胞壁酶解，形成原生质体或球质体。,由于酶分解了细胞壁的坚实组分，细胞变得对渗透压敏感。因此，,当原生质体或球质体转入低渗溶液中时，就会遭受渗透冲击而崩解。,这种方法比较温和，但细胞壁却遭破坏。,分离细胞器和自细胞中分离酶时，常采用这种方法。,51,细菌细胞的破碎,组成真细菌细胞壁的坚实成分是,肽聚糖,，它,可被溶菌酶分解。,革兰氏阳性细菌,细胞壁的成分主要是肽聚糖，用溶菌酶处理，容易获得原生质体。处理方法是将革兰氏阳性细菌细胞悬浮在,pH,中性的高渗蔗糖溶液中，加入,1.0mg/ml,溶菌酶，于室温下处理,10min,，,就可形成失去细胞壁的原生质体。,52,革兰氏阴性细菌,细胞壁成分比较复杂，在肽聚糖层外，还有脂多糖的外层，溶菌酶不能透过外层，因而不能分解细胞壁内部的肽聚糖层。,通常采用反复冰冻融化，或用,EDTA,处理，破坏脂多糖层，使溶菌酶进入,内部，分解肽聚糖。因为溶菌酶不能分解脂多糖，,所形成的原生质体外仍残留有细胞壁的表层，这样的原生质体，通常称为球质体。,一般采用以下的方法制备革兰氏阴性细菌的球质体。,53,离心收集细胞,悬浮于,5,10,倍体积的以,10mmol/LTris,醋酸缓冲液（,pH7.8,）配成的,0.75mol/L,蔗糖的冷溶液中。,加入溶菌酶至最终浓度为,0.lmg/ml,，置冰上保持,2min,。,然后在,8,10min,内缓慢加入,2,倍体积的冷的,1.5mol/L EDTA,溶液，并随时轻微搅匀，细胞将转变为对渗透敏感的球质体。,54,原生质体和球质体的形成，受一系列因素的影响，特别是收获细胞的时间至关重要。,一般在对数生长中期所收获的细菌最适合制备原生质体和球质体。,低渗崩解,用相差显微镜检查原生质体或球质体形成的情况。当大多数细胞已转变成原生质体或球质体时，离心收集原生质体或球质体，并快速加入,5,10,倍体积的蒸馏水或稀缓冲液，使之崩解。,降低粘度,当原生质体或球质体崩解时，会放出,DNA,，使裂解液变得粘稠，可用超声波作瞬时处理，打断,DNA,，以降低粘度，或加入,DNA,酶将,DNA,分解。,55,酵母菌和丝状真菌原生质体,制备酵母菌和丝状真菌的原生质体的原理同上。但采用不同的酶分解细胞壁。因为各类真菌的细胞壁的化学组成不同，所采用的酶也不一样。,蜗牛酶 原生质体再生的能力差，因为蜗牛,酶中混有脂酶和蛋白酶，容易破坏细胞质膜,的结构。,几丁质酶和,-,葡萄糖苷酶 原生质体,再生能力强。,纤维素酶分解藻类的细胞壁，能制备出较,满意的藻原生质体。,56,差速离心,差速离心法可将形状、大小不同的颗粒，在不同的离心力下分开。将细胞裂解液先在低速下离心一定时间，大颗粒沉下，中、小颗粒悬浮在,“,上清夜,”,中。将这种,“,上清液,”,在加高转速的情况下离心，得到中等颗粒的沉淀，小颗粒仍悬浮在上清液中，再加高转速离心小颗粒也沉出。这样,逐步加高转速离心，就可将具有不同沉降速度的各种亚细胞结构的颗粒分开。,2.2.2,亚细胞结构的分离,57,差速离心分离啤酒酵母的各种亚细胞结构,酵母菌细胞破裂液,完整细胞,上清液,细胞质膜,上清液,线粒体,上清液,核蛋白体,上清液,(,可溶性小分子,),1200g,，离心,15min,5000g,，离心,15min,10000g,，离心,15min,100000g,，离心,15min,细胞壁,细胞壁,完整细胞,重新悬浮,自然沉降,58,区带离心,区带离心所,采用的介质是不同浓度梯度的蔗糖溶液，可以防止离心时形成上下对流，因此在一次高速离心下，就可以将,颗粒大小不同的物质,，按它们的沉降速度不同，分成一些区带，颗粒大小不同的物质会聚集成一区带。,分离真细菌细胞的亚细胞结构时，将细胞破裂液铺加一层于事先作好的含有不同浓度梯度的蔗糖溶液的离心管的最上层，在,100000g,下离心,1-4h,，即可将颗粒大小不同的亚细胞结构分成不同的区带59,所用蔗糖浓度，在离心管的最下层是,45%,（,W/V,），然后小心地沿离心管加入一层,40%,蔗糖溶液（每层加,5ml,）。如此依次加入,不同浓度梯度的蔗糖溶液,介质，所用的离心管为透明塑料管，可清楚看到不同浓度蔗糖溶液的界面。,45%,40%,35%,25%,30%,在上样离心之前要避免振动此离心管。应采用,甩平转头,。,离心后，分别吸出各个区带，或将离心管底部穿刺一个小孔，分别收集各个区带。静化处理后可进行电镜观察。,60,平衡密度梯度离心,这种离心方法可将,浮力密度相同,而大小不同的颗粒分开,，在分离各种膜结构时，常采用此法。因为来自同一种膜的碎片，在形状、大小上可能相差很大，但它们的密度是相同的。通常采用蔗糖密度梯度分离密度小于,1.3g/ml,的颗粒；用,CsCl,分离密度较大的颗粒，,离心要达到每种颗粒都移动到与其周围介质的密度等同的地方，,形成区带。,这往往需要高离心力和长时间的离心，才能达到平衡。,61,细胞表面附属物是指细胞壁外面的亚细胞结构，包括作为运动器官的鞭毛或纤毛，起固着作用的菌毛，起接合作用的性毛以及起保护作用的荚膜和粘液层。并非所有的细胞都有表面附属物，这些表面附属物也不是细胞生命所必需，失去它们，细胞仍可生活，但在生理活动上会有影响。,2.3,表面附属物,62,有些微生物细胞表而有鞭毛或纤毛作为运动器官。原核细胞的鞭毛和真核细胞的鞭毛，在细微结构和化学组成上不同，它们的运动方式也各异。,只有细菌才有菌毛和性毛。,2.3.1,鞭毛、菌毛和性毛,63,2.3.1.1,细菌的鞭毛,有些细菌（不是全部）的表面有鞭毛，或极生（单毛或束毛,),，或周生。细菌的鞭毛纤细，直径,12,18nm,，呈波浪形，需要用特殊方法染色后，才能在光学显微镜下看到。,鞭毛多生长于对数生产期的细胞，老龄细胞常失去鞭毛。易受振荡脱落，可再生。,结构,细菌鞭毛由,鞭毛丝、鞭毛钩和基体,三部分组成。,64,65,鞭毛丝,鞭毛丝是鞭毛的主体，其长度和波形，因不同菌种而异。,组成鞭毛丝的成分是鞭毛蛋白。,在酸性条件，或以去污剂处理时，鞭毛丝可解聚成许多亚单位。鞭毛丝大多由一种鞭毛蛋白亚单位组成。但也有两种鞭毛蛋白亚单位组成的。,鞭毛蛋白具有抗原特异性称为,H,抗原。,66,鞭毛钩,鞭毛钩呈弯头状，直径,17nm,，长约,900nm,，约,占鞭毛干重的,1%,，,由它连接鞭毛丝和基体。,鞭毛钩是由一种蛋白亚单位组成的，亚单位的分子量因不同菌种而异。,基体,基体固着在细胞质膜上，穿过细胞壁与鞭毛钩连结。,基体的构造复杂，,革兰氏阴性菌,（以大肠杆菌为代表）的,鞭毛基体由,4,个环和,1,个中轴所组成，,M,环,位于细胞质膜中，壁外层的脂多糖层中。,S,环,固定在细胞壁上，,P,环,位于细胞壁的肽聚糖层中，,L,环,则位于细胞壁外层的脂多糖层。,67,细菌鞭毛的超微结构,68,放大一百万倍的大肠杆菌的横切面绘制图,69,鞭毛功能,细菌的鞭毛是运动器官，,其运动的方式是,螺旋转动,。每前进一段后，就翻腾转向一次。,当鞭毛逆时针转动时，细菌就作直线跑动，顺时针转动时，细菌就翻腾转向。,70,细菌的运动有趋化性,，它总是朝向营养物质浓度高的地方运动,（即朝向正刺激物游动），而背向不利生长的物质（即负刺激物）。原因是,刺激物会影响翻腾的频率,，当朝向,正刺激,物游动时，翻腾的,频率小,，而前进（跑）的时间长。当避开,负刺激物,时，翻腾的,频率大,，而前进的时间短。,71,2.3.1.1,细菌的菌毛,有些细菌表面着生有纤细的菌毛，菌毛较鞭毛细，短而直，由许多蛋白质亚基排列而成。菌毛并非运动器官，,其功能,可能是用以,附着在基物上，与致病性有关。有菌毛的细菌，在液体静止培养时会形成菌膜。,72,鞭毛和菌毛,普遍变形杆菌的长鞭毛和大量的短菌毛在电镜照片中清晰可见,73,细菌的性毛,性毛主要存在于某些革兰氏阴性菌的表面，它的功能是使细菌接合。,性毛在形态上与鞭毛和菌毛都不同。性毛的主要功能是在细胞接合时起桥梁作用。,74,2.3.1.2,真核微生物的鞭毛和纤毛,某些低等的水生真菌和藻类的游动孢子和配子以及许多原生动物细胞表面有鞭毛，单极生或双极生。,鞭毛和纤毛是运动器官，二者内部结构也相似，只不过鞭毛长，纤毛短。,鞭毛和纤毛主要由鞭杆和基体所组成。鞭杆和基体之间有一过渡区。鞭杆伸出细胞之外，基体则埋在原生质膜中。鞭杆外包围着一层单位膜，此膜与细胞质膜相连。细菌鞭毛则没有膜包围。从鞭杆的横切面看，,中央有一对微管，由中央鞘包着；外围环绕有,9,对二联体。微管的这种排列，称为,9+2,型。,75,76,功 能,真核细胞的鞭毛或纤毛的功能是运动，,但和细菌鞭毛的运动方式完全不同。,它们是以波浪形摆动（鞭打）以推动细胞前进，,而不是像细菌鞭毛那样转动。真核细胞鞭毛摆动需要能量，能量来自,ATP,的分解，每摆动一次要消耗,1,分子,ATP,。关于纤毛和鞭毛运动的机制，目前一般都接受,Stair,于,1974,年所提出的,“,滑动微管模式,”,假说。,7778,许多微生物在细胞壁外围有荚膜和粘液层。荚膜和粘液层可自细胞上除去而不影响其生命。在形态上它们可以分为三类：,大荚膜,在光学显微镜下可见，有明确的外界面。因为组成这些荚膜的物质不易被染色，通常是用黑墨水负染后观察；,微荚膜,在光学显微镜下看不见，但用免疫学的方法可以测出它们的存在。,粘液层,它积累在微生物细胞的表面而没有特定的形态结构。产生荚膜的微生物也时常产生粘液层，其组成成分不同于荚膜。,2.3.2,荚膜和粘液层,79,细菌的荚膜,80,荚膜和粘液层的产生，决定于微生物的菌系和营养环境，有荚膜的微生物也可能发生突变，成为没有荚膜的变种。,前者在固体培养基上形成粘的光滑菌落。而没有荚膜的菌系形成粗糙的菌落。,提取荚膜和粘液层的方法：,1.,离心培养物；,2.,稀酸或稀碱提取荚膜。,81,化学组成,水是荚膜和粘液层的主要组分。,某些芽孢杆菌的荚膜，,主要是由多聚谷氨酸组成的，,有的还连接有多糖。谷氨酸或,D-,型或,L-,型。,某些链球菌具有微荚膜，其中含有蛋白质，有抗原性，被称为,M,抗原。,最常见的荚膜和粘液层的有机成分是多糖。,1.,同多糖，即由一种单糖聚合而成的多糖。,2.,杂多糖，由多种单糖聚合而成的多糖。,荚膜和粘液层与细胞壁之间,是如何连接的，大多不明。有人认为,是离子键，有些细菌中发现可能以共价键，,和细胞壁中的成分结合。,82,功能,荚膜和粘液层似乎并非细菌生活所必需，但却有,保护作用。,具有粘液的细菌可以,免遭脱水而死亡。,有荚膜的细菌在寄主体内可,免遭吞噬细胞的消化，,因此在致病性上有重要作用。由于突变失去荚膜后，也失去了致病性。,炭疽杆菌感染小鼠脾组织涂片，菌体有荚膜,83,细胞壁通常由两类物质组成,一类形成细胞壁的坚实骨架，,另一类是胞壁间质。,除去间质，不会导致细胞变形，但除去骨架，则细胞将变为球形。在适合的条件下，失去细胞壁的细胞仍能存活，并能再生细胞壁。,不同微生物的细胞壁的结构和化学组成各异，是分类鉴定的一个重要指标。,2.4,细胞壁,84,真细菌,细胞壁的骨架物质都是,肽聚糖,，因组成间质的物质的不同，而区分成革兰氏阳性和阴性菌前者含磷壁酸，后者含脂多糖和脂蛋白。,古细菌,细胞壁不含肽聚塘，但其中的某些产甲烷细菌的细胞壁中有类似肽聚搪的物质，被称为,假肽聚糖,，而某些嗜盐细菌和嗜热嗜酸细菌以及另外的一些产甲烷菌的细胞壁则是由,蛋白质或糖蛋白,所组成。,真核微生物,真菌和藻的细胞壁大多由,各种多糖所组成,，其成分各异。,85,细菌细胞壁的生物化学研究是近,30,年来微生物生理学领域中重大进展。不仅了阐明了细胞的细胞壁分子结构，发现在肽聚糖和磷壁酸，也阐明了某些抗生素的作用机理，并对细胞的特异性抗原的性质，有了深入的了解。,肽聚糖几乎所有细菌细胞壁中都有肽聚糖，它是由,N,乙酰胞壁酸和,N,乙酰氨基葡萄糖。以,1,，,4,糖苷键交替连接起来的多聚体。,由于在,N,乙酰胞壁酸上连续有短肽链，而被称为肽聚糖。,2.4.1,真细菌的细胞壁,86,G,+,细菌的细胞壁,革兰氏阳性细菌细胞璧,平均厚度约为,13-35nm,，最厚的可达,80nm,。,87,肽聚糖结构,N-,乙酰胞壁酸,N-,乙酰葡萄糖胺,肽链,五甘氨酸肽桥,88,组成连接在,N,乙酰胞壁酸上的短肽链的氨基酸的特点,L-,丙,D-,谷,DA,D-,丙,二氨基庚二酸,L-,赖氨酸,D-,鸟氨酸,L-,二氨基丁酸，等,DA,是指二氨基酸,L-,丝,D-,谷,氨酰胺,89,磷壁酸,除肽聚糖外，,G,+,细胞壁的另一主要成分是磷壁酸。用稀酸或碱可将细胞璧中的磷壁酸抽提出来。其量约占细胞壁干重的,50%,。,磷壁酸可分为三种：核糖醇磷壁酸、甘油磷壁酸和脂磷壁酸（膜磷壁酸）。,磷壁酸可以以共价键与肽聚糖相连接。,核糖醇磷壁酸、甘油磷壁酸,可以,结合高浓度的二价阳离子，尤其是,Mg,2+,，,这有利于细胞壁中的酶活性和保持细胞膜完整。,甘油磷壁酸,90,脂磷壁酸,源于原生质膜，并垂直伸向细胞壁外，,它是由磷壁酸和糖脂组成的大分子化合物。,具有抗原特异性，,其抗体能引起细胞壁或完整的细胞团聚，因此推测脂磷壁酸会穿过细胞壁之外，才有可能接受受体。,壁醛酸,当某些革兰氏阳性细菌生长在,限量磷酸盐的培养基中时，往往不能合成磷壁酸，而代之以壁醛酸。,它是,由糖醛酸和氨基己糖交替连接,而形成的酸性杂多糖，分子结构中不含磷壁酸。,91,磷壁酸的主要生理功能,一,通过分子上的大量负电荷,浓缩,细胞周围的,Mg2+,，以,提高,细胞膜上一些,合成酶的活性,。,二 贮藏元素。,三 调节细胞内自溶素,（,autolysin,）的活力，借以防止细胞因自溶而死亡。,四,作为,噬菌体,的特异性,吸附受体,。,五,赋予,G+,细菌特异的,表面抗原,，因而可用于菌种鉴定。,六,增强某些致病菌对宿主细胞的粘连，,避免被白细胞吞噬，并有抗补体作用。,92,G,-,细菌的细胞壁,革兰氏阴性细菌的细胞壁一般都较薄。但是，革兰氏阴性细菌细胞壁的结构却比较复杂。在电子显微镜下观察细菌的超薄切片，可看到细胞壁呈现出多层结构，,可区分为外层和内层。,细胞壁外层的外侧由脂多糖组成；内侧则由磷脂组成。外层中镶嵌着蛋白质。,内层由肽聚糖组成，,但含量较少，,仅有几层。,细胞壁的外层和内层之间由脂蛋白以共价键连接起来。,93,G,-,细菌的细胞壁,94,脂多糖（,LPS,）,脂多糖位于革兰氏阴性细菌细胞壁的最外侧，,它由,O,抗原寡糖，核心寡糖和脂,A,三部分组成。,1.O,抗原寡糖,是由,4,或,5,种单糖所组成的几个重复单位的聚合体。糖的种类和排列因不同菌而异，,具有抗原特异性，称,O,抗原。,这样的重复单位聚合成为长链，伸向细胞壁外。,2.,核心寡糖,组成核心寡糖的糖类主要由己糖庚糖、辛糖酸及磷酸和乙醇胺组成。,3.,脂,A,脂,A,的基本结构是二个氨基葡萄糖组成的二糖。,脂,A,有毒性，是一种内毒素。,O,抗原寡糖,核心寡糖,脂,A,95,96,脂蛋白,脂蛋白的脂部分构成细胞壁外层的内侧，与之共价结合的蛋白，则可能以其另一端,与细胞壁内层的肽聚糖分子共价结合,。,肽聚糖,G,-,细菌细胞壁内含肽聚糖不多，,只有少数几层,，一般只占细胞干重的,5%,10%,，其仅位细胞壁外层之内，细胞质膜之外。,综上所述，,G,-,细胞壁的外层也是,双分子层,组成的，形如细胞质膜的磷脂双层结构，其中也镶嵌着各种蛋白质。,G,-,细菌细胞壁的外层也,具有选择渗透作用,，只允许分子量,600,1000,之间的分子自由通过。各种溶质运输的,蛋白及各种水解酶类,都位于细胞壁与细胞质膜之间的,周质空间,，,而,G,细胞,所产生的水解酶类，大多都,分泌出细胞壁外,。,97,2.4.2,古细菌的细胞壁,嗜热菌的生境,a.,黄石国家公园的间歇喷泉,b.,黄石国家公园中的硫火山口,98,古细菌是近年来被建立起来的一类特殊的细菌。根据化学组成可将古细菌的,细胞壁分为两大类,：,一类是由假肽聚糖或酸性杂多糖组成的；,假肽聚糖,与肽聚糖结构十分相似，,是由,N,乙酰氨基葡萄糖与,N,乙酰塔罗糖醛酸交替以,1,，,3,键连接成为多糖链。,因此对溶菌酶不敏感，因为短肽链中没的,D,丙氨酸，所以对干扰,D,丙氨酸的抗生素，青霉素和万古霉素不敏感。,99,另一类是由六角形规则排列的蛋白质或糖蛋白的亚单位组成。,古细菌并没有共同的细胞壁成分。古细菌大多生活在极端环境下，而细胞壁又直接暴露在环境中，因此研究其细胞壁的组成和结构具的重要意义。,独特多糖细胞壁,甲烷八叠球菌,(,Methanosarcina,),的细胞壁含有独特的多糖，并可染成革兰氏阳性。这种,多糖含半乳糖胺、葡糖醛酸、葡萄糖和乙酸，不含磷酸和硫酸。,硫酸化多糖细胞壁,极端嗜盐古生菌,盐球菌属,(,Halococcus,),的细胞壁是由,硫酸化多糖组成,的。其中含葡萄糖、甘露糖、半乳糖和它们的氨基糖，以及糖醛酸和乙酸。,100,糖蛋白,(glycoprotein),极端嗜盐的另一属古生菌,盐杆菌属,(,Halobacterium,),的细胞壁是由糖蛋白组成的，,其中包括葡萄糖、葡糖胺、甘露糖、核糖和阿拉伯糖，而它的蛋白部分则由,大量酸性氨基酸尤其是天冬氨酸组成,。这种带强负电荷的细胞壁可以平衡环境中高浓度的,Na+,，从而使其能很好地生活在,20%,25%,高盐溶液中。,蛋白质细胞壁,少数产甲烷菌的细胞壁是,由蛋白质组成的,。但有的是由几种不同蛋白组成，如甲烷球菌,(,Methanococcus,),和甲烷微菌,(,Methanomicrobium,),，而另一些则由同种蛋白的许多亚基组成，例如甲烷螺菌属,(,Methanospirillum,),。,101,真菌细胞壁的,主要成分是多糖,，此外也含有少量,蛋白质和脂类,。,2.4.3,真菌的细胞壁,葡聚糖和甘露聚糖,纤维素组成细胞壁骨架,几丁质和葡聚糖,102,2.4.3.1,酵母菌细胞壁,厚约,70nm,，主要成分是,葡聚糖、甘露聚糖蛋白质和几丁质,，三者共占细胞壁干重的,90%,以上。此外还含有少量的脂类。,甘露糖蛋白,几丁质,麦角甾醇,103,葡聚糖,由,D,葡萄吡喃糖以,，,16,键连接，支链点有,12,、,13,、,14,连接的。随着微生物种类和生长条件的不同，其结构也有差别,啤酒酵母菌细胞壁葡聚糖,-1,，,3-,葡聚糖,葡聚糖,-1,，,6-