1、
紫外吸收法测定蛋白质浓度
一． 目的
1. 了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理。
2. 熟悉紫外分光光度计的使用。
二． 原理
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯尔比尔定律：
A=abc
“A”为溶液的吸光度值，“b”为石英比色池的厚度，“c”为蛋白质溶液的浓度。
紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的
2、选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。
紫外-可见分光光度法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，如下所示：
由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池对样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围
3、内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。
由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处。如同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。以此如溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm处的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。
三． 器材
1. 1800S型紫外可见分光光度计
2. 容量瓶100ml（×1）
3. 试管若干
4. 移液管若干
5. 吸水纸
6. 檫镜纸
四． 试剂
1. 酪蛋白标准溶液：1mg/ml
2. 样品液：血清 稀释100倍
4、
五． 操作
（一） 直接测定法
在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以去离子水为对照，测定280nm及260nm两种波长的吸光度（A280nm及A260nm）。
将280nm及260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。
C=1.45A280nm-0.74A260nm
式中：C：蛋白质质量浓度（mg/ml）
A280nm：蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度
A260nm：蛋白质溶液在260nm处测得的吸光度
本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还是用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往比较困难。
5、 为简便起见对于混合蛋白质溶液，可用A280nm乘以0.75来代表其中蛋白质的大致含量（mg/ml）。
（二） 标准曲线法
1. 标准曲线的绘制
取8支干净试管，编号，按表加入试剂。（注意要做平行实验消除偶然误差，做空白实验消除系统误差。）
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1mg/ml酪蛋白标准液
0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
/
/
/
样品液
/
/
/
/
/
/
2.5
2.5
2.5
蒸馏水
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0
2.5
2.5
2.5
6、A280nm
0
0.177
0.306
0.517
0.683
0.870
0.391
0.400
0.385
加毕，混匀。用紫外分光光度计测A280nm，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。
2. 样液测定
样品测量液吸光值应在标准曲线适用范围内。（平行实验）
（三） 公式法
如果是纯蛋白质样品（或核酸含量在0.5％以下，即A280nm/A260nm＜1.5 ，可根据该蛋白质在280nm附近的标准吸光系数，直接测定该蛋白质的含量。如牛血清白蛋白在280nm附近的标准吸光系数为6.3，测待测样品中牛血清白蛋白含量可用下式计算：
样品中牛血清白蛋白质量浓度（
7、mg/ml）= (A280nm×10)/6.3
六． 注意事项：
石英比色皿比较贵重，且易碎，使用时要小心；
绘制标准曲线时，蛋白质溶液浓度要准确配制，作为标准溶液；
测量吸光度时，比色皿要保持洁净，切勿用手玷污其光面。
七、思考题：
紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法有何优缺点？受哪些因素的影响和限制？
答：优点是：方法简单、灵敏、快速、高选择性，且稳定性好，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。
缺点是：仪器昂贵，而且不同的蛋白质的紫外吸收是不相同的，测定结果存在着一定的误差，受光源、溶液的PH值、比色皿材质、缓冲介质溶液等因素的影响和限制。
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