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用于100%水溶液流动相中的反相色谱柱
引言
如果流动相中有机溶剂含量低于5%，对用于强极性物质分离的反相高效液相色谱柱来说，是很难获得足够的保留时间的，因为含有“高比例”水的流动相很难完全润湿与亲油基团联结的固定相，致使固定相坍塌，导致柱效降低，重现性变差，平衡时间变长。
CenturySIL C18 AQ反相高效液相色谱柱是解决化合物要求高，甚至是100%纯水做流动相问题的理想方法，这种在固定相硅烷基处的极性作用能提高色谱柱的“润湿能力”，从而改善柱效、保留时间和重现性。
在高比例水中保留值的重现性问题
当分离强极性和水溶性化合物时，为获得足够的保留时间，通常流动相中有机溶剂（甲醇、乙腈等）浓度不到10%，在这种操作条件下，保留时间的重现性不好。实验时，我们发现随着色谱柱使用时间的增加，色谱峰的保留时间越来越短，而分离度变的越来越差，见图1：

色谱柱：YMC ODS
流动相：5%CH3OH
95% 0.1M KH2PO4
流 量：1Ml/min
样 品： 1、Vitamin C 3、Vitamin B6
2、Vitamin B1 4、Nicotimamide

图1 相坍塌导致重现性变差

经过72小时反复实验，可以看出，相坍塌导致保留时间减少8%。
普通的C18或C8的色谱柱保存在高比例水的流动相中会加速相坍塌。用一支C18的色谱柱进行实验，得到谱图A。将该色谱柱在100%纯水中保存一夜，第二天在同样的操作条件下，得到谱图B。实验表明：由于相坍塌，保留时间和分离会产生戏剧性变化。详见图2：
色谱柱：Zorbax StableBond SB-C18,4.6x150mm
流动相：10% Acetonitrile
90%0.050M Phosphate buffer,Ph2.6
样 品：1、Uracil 5、3-cyanobenzoic acid
2、Nitroethane 6、3,5-dimethylaniline
3、Phthalic acid 7、1-nitrobutane
4、4-chloroaniline

图2 相坍塌减少保留时间和分离度变差

我们把这种保留时间的变化称之为疏水的C18或C8的烷基链在高比例水流动相条件下的“相坍塌”。 在通常情况下，固定相的烷基在流动相溶剂和样品的分子中有充足的伸展空间，而当使用含高比例水的流动相时，烷基相有自身坍塌的趋势，当这种情况发生时，保留时间就会受到影响，详见图3：

图3 相坍塌

当发生相坍塌时，烷基与溶质的相互作用减弱，而保留时间变短。这就证明相坍塌能以高比例水的流动相来代替固定相中的毛细孔，减少填料表面积的可利用性，从而减少了保留时间。
在高比例水中保留值重现性问题的解决办法
当使用的流动相中有机溶剂的浓度小于10%时，如果我们要解决保留时间重现性的问题，可尝试以下几种方法：
1、 用含有机溶剂的浓度大于50%的流动相定期的清洗色谱柱。色谱柱每一次使用时的情形都是不同的，但如果是相同的实验条件，保留时间相差超过5%，此时，应该清洗色谱柱；
2、 不要让含高比例水的流动相保留在色谱柱内。这就可以避免相坍塌的加速，防止固定相中的毛细孔与高比例水的流动相的联合替换
3、 在高比例水的流动相下，如果由于运行时间短而出现很短的保留时间，这种情况下，色谱柱要用含有机溶剂低于50%的流动相冲洗。在另一些情况下，我们必须用含有机溶剂高于75%的流动相冲洗色谱柱。在高压下冲洗色谱柱有助于使流动相进入固定相毛细孔内；
4、 使用没有出现过相坍塌现象的柱子；
一支碱性去活的C8色谱柱在100%纯水流动相操作条件下，运行10分钟后，保留时间减少5分钟，但用有机溶剂冲洗色谱柱后保留时间重现，详见图4：

色谱柱：Base deactivated
流动相：0.1%Acetic acid in water
样 品：Amoxicillin

图4 相坍塌对保留时间的影响

这由于有机溶剂使疏水的固定相展开，使烷基相能重新在流动相中伸展，并允许有机溶剂依附固定相的毛细管的表面上。遗憾的是，如果继续使用含高比例水的流动相，固定相会再次坍塌，保留时间也随之产生变化。
CenturySIL C18 AQ反相色谱柱的特点
色谱柱的生产者通常用极性硅烷做键合相或用亲水基团封尾来避免相坍塌的问题，这两种方法都能在保持烷基在流动相中的伸展上都可以达到期望的要求。即使当使用100%的水做流动相时，通过保持烷基的伸展，色谱峰的重现性也会大大的加强，详见图5：

图5极性键合固定相亲水基封尾

CenturySIL AQ系列填料是在固定相的硅键上键合醚基团而成的，极性的醚基团能使水润湿并渗透到硅烷表面，抑制烷基链自身的伸展，即使在100%纯水的流动相中，这种特殊的键合技术也能使碳链得到充分伸展。因此，CenturySIL AQ系列色谱柱常被指定在含高比例水的流动相的操作条件下使用，而且该系列色谱柱不仅有利于在水溶性的化合物中提高保留时间，同时也能改善重现性，详见图6：
色谱柱：HydroBond AQ C8
4.6x250mm,5μm
流动相：0.05M KH2PO4，pH2.4
流 速：1Ml/min
样 品：1Oxalic acid 2、Tartaric acid
3、Formic acid 4、Malic acid
5、Malonic acid6、Lactic acid
7、Malecic acid8、Fumaric acid

图6 改善水溶性化合物的保留时间

CenturySIL AQ系列填料采用极性基团键合技术得水更易润湿硅烷表面，不仅可以很好的在含高比例水的流动相中使用，对反相色谱柱来说，它对一些化合物还有很好的对称性。除了用离子交换试剂做固定相，其它的保留时间是足够的，因此，色谱操作条件是简单的，但方法是曲折的。
CenturySIL AQ系列填料在对有机酸、芳香酸、水溶性的维他命、嘌呤、嘧啶碱类和在反相色谱柱有很短甚至没有保留时间的其他化合物的分析时，即使在没有离子对试剂的100%的纯水流动相中也能对其进行分离。
为了加强极性选择性和改善色谱柱长时间使用带来的杂质，许多嵌合相被用于专一的色谱柱，或被生产者指定。但是，在实际过程中没有出现过相坍塌问题的极性嵌合相，有利于在含高比例水的流动相条件下操作使用。CenturySIL C18 EPS是我们已发现的在高比例水操作条件下，运行很好的一例极性嵌合相色谱柱。
CenturySIL C18 EPS 是极性嵌合选择性填料，对极性化合物的分离，它比典型的碱性去活固定相(CenturySIL C18 BDS)具有更大的选择性，详见图7：

流动相：65% Acetonitrile
35%0.050M phosphate buffer
PH3.2
样 品： 1、Uracil
2、Pyridine
3、Phenol
4、N,N-Dimethylaniline
5、p-Butylbenzoic acid
6、Toluene

图7 极性键合固定相加强极性选择性

分离碱性化合物，采用极性嵌合固定相（CenturySIL C18 EPS）能改善拖尾因子，这是因为键合上的氨基基团能够溶解与固定相中二氧化硅分子相联的硅烷醇，从而减小拖尾因子，详见图8：

流动相：80% Methanol
20%0.025M Phosphate buffer
PH6.0
分析物：Amitripryline

图8 极性键合固定相改善拖尾因子

通常在许多分离中，由于硅烷表面的有效保护，在流动相中要求有缩氨酸结构的三氟乙酸，我们通常使用稀乙酸或甲酸来完成的，这就大大的提高了在LC/MS应用中的灵敏度

结论
当使用含高比例水的流动相时，典型的C18和C8色谱柱常遇到差的重现性。当使用这些色谱柱时，应该避免使用含有机溶剂低于10%的流动相。实验过程中如果没有使用高比例水的流动相，所采用的样品仍然没有得到足够的保留时间，建议你使用CenturySIL AQ系列色谱柱，如果在分离物遇到相坍塌，我们还不能确定在图1或图2的色谱峰，此时，反复的用含有机溶剂低于50%的流动相冲洗色谱柱，可以降低相坍塌的影响。