胰岛素上课讲义.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,胰 岛 素,（三）胰岛素（Insulin）,胰岛素广泛存在于人和,动物的胰脏,中，正常人的胰脏约含有,200万,个胰岛，胰岛由,-、-和-三种细胞组成,，其中-细胞制造,胰岛素,，-细胞制造,胰高血糖素,和,胰抗脂肝素,，-细胞制造,生长激素抑制因子,。胰岛素在-细胞中开始时是以活性很弱的,前体胰岛素原,存在的，进而,分解,为胰岛素进入血液循环。,(1)结构和性质,胰岛素由51个氨基酸组成。,不同种属动物的胰岛素,分子结构大致相同,，主要差别在,A链二硫桥中间的第8、9和10位上的三个氨基酸及B链C末端人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸,抗原性比,其他来源的胰岛素要低。,(2)胰岛素的性质,白色或类白色结晶粉末，晶形为扁斜形六面体。,牛胰岛素的分子量为5733，猪为5764，人为5784。胰岛素的,等电点为5.35.4,。,胰岛素在,pH4.56.5范围内几乎不溶于水,，,易溶于稀酸或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解,；,在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶,；在,乙醚中不溶。,在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。,水溶液中胰岛素分子受pH、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚现象。在低胰岛素浓度的酸性溶液时呈单体状态。锌胰岛素在pH=2的水溶液中呈二聚体，聚合作用随pH升高而增加在pH=4-7时聚合成不溶性无定形沉淀。,在,高浓度锌,的溶液中，,pH68,时胰岛素溶解度急剧下降，pH大于9时解聚并由于单体结构改变而失活。,在pH=2的酸性水溶液中加热至80-100度，可发生聚合而转变为无活性的纤维状胰岛素，如及时用冷0.05mol/L氢氧化钠处理，仍可恢复为有活性的胰岛素结晶。,具有蛋白质的各种特殊反应；胰岛素能被胰岛素酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶水解而失活。,多种还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、维生素C及多种重金属等都能使胰岛素分子中二硫键被还原、游离氨基被酰化游离羧基被酯化和肽键水解而导致胰岛素失活。,胰岛素对高能辐射非常敏感；能被活性炭、白陶土、氢氧化铝、磷酸钙、CMC等吸附。,（1）工艺流程：,2、生产工艺,（2）工艺过程及控制要点,3、质量检验,（1）原料质量控制,不同种类和年龄的动物，胰脏中胰岛素的含量有差别。,采摘胰岛素要保持腺体组织的完整；离体后要立即深冻，先在-30度以下急冻后转入-20度保存备用。,（2）生产过程质量控制,浓缩工序的条件对胰岛素收率影响很大，尽量缩短浓缩液受热时间,（3）产品性状,（4）产品纯度要求,常规的结晶胰岛素纯度不够高，需进一步层析纯化。采用超细Sephadex G-50凝胶过滤。,美、英药典主要控制两个指标，即相对分子质量大于胰岛素的蛋白质和胰岛素原。国外一般要求胰岛素原核脱酰胺胰岛素含量在10*10-6，1000*10-6以下。,4、胰岛素制剂,新剂型：眼用膜剂、鼻腔给药的气雾剂、直肠用栓剂以及口服的脂质体、微囊、乳剂等。,5、酶促半合成人胰岛素,6、重组DNA技术,另一种方法是用分泌型载体表达胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。,蛋白质工程,胰岛素分子中取代一个氨基酸残基，防止单体二聚化，由此合成的新型胰岛素在药物浓度下基本上保持单体，注射后吸收速度比正常胰岛素快2-3倍。,胰岛素B链第10位His变为Asp，受体结合能力和离体生物活力分别为猪胰岛素的262%和235%。,（四）生长素,人生长素对人肝细胞有增加核分裂作用，对人红细胞有抑制葡萄糖利用的作用，对人白细胞或淋巴细胞有促进蛋白质和核酸合成的作用，有促进骨骼，肌肉，结缔组织和内脏增长的作用。,动物生长素能促进家禽生长，增加产量，在畜牧业领域有很好的应用前景。,不同种属的哺乳动物的生长激素之间有明显的种属特异性，只有灵长类的生长素对人有活性。,目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，产品已投向市场。,1、结构和性质,人的生长素是由一条191个氨基酸的多肽链所构成的蛋白质，分子中有两个二硫键，相对分子量21700.等电点4.9.,胰岛素N端的1-134氨基酸肽链段位活性所必需，C端的一段可能起保护作用，使生长素在血液循环中不致被酶所破坏。,人生长激素分子相对稳定，冰冻下活性可保持数年。,2、生产工艺,（2）工艺过程,（五）白细胞介素-2和白细胞介素,白细胞介素是介导白细胞间相互作用的一类细胞因子，是淋巴因子家族的一员。,目前已有IL-118，目前对IL-16研究较多。,目前上市的白细胞介素只有IL-2。,IL-2是由辅助T细胞经抗原或丝裂原等刺激，在巨噬细胞或单核细胞分泌的IL-1参与下，产生并分泌的糖蛋白。,IL-2能诱导T细胞增殖与分化，刺激T细胞分泌,-干扰素，增强杀伤细胞的活性，在调节免疫功能上具有重要意义。临床上用于治疗一些免疫功能不全以及癌症的综合治疗，另IL-2对创伤修复也有一定的作用。,1、IL-2结构与性质,人IL-2前体由153个氨基酸残基组成，在分泌出细胞时，含有20个氨基酸的信号肽被切除，产生成熟的IL-2分子。,IL-2分子质量为15420，不同来源的IL-2分子不均一。,在人IL-2的第58、105、125位是Cys，其中第58、105形成分子内二硫键，这对保持其生物活性是必不可少的。,IL-2在pH=2-9范围内稳定，对各种蛋白酶均敏感，对DNA、RNA酶不敏感。,重组IL-2因细菌缺少翻译后的修饰功能都不是糖蛋白，相对分子质量为14000，PI大部分为7.7。,应用蛋白质工程技术在IL-2中125位的Cys分别由Ser或Ala取代，可制成生物活性、热稳定性和复性效果都比原IL-2强的新型白介素。,2、传统生产工艺,（1）工艺路线：,4、基因工程IL2的制备,（1）IL-2基因结构,（2）cDNA克隆的制备,从ConA激活的人白细胞T细胞株提取高活性IL-2mRNA作为模板。逆转录单链cDNA。,经末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA末端连接若干dCMP残基，引物存在下，利用DNA聚合酶成双链cDNA。,分离cDNA片段，G-C加尾法基因重组,（3）IL-2的表达和纯化,利用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞已经成功表达了重组人IL-2。,工程菌经发酵培养和诱导表达，收集裂解菌体，离心沉淀收集包涵体。包涵体主要含由IL-2单体分子聚合而成的多聚体，不溶于水，且其中的重组IL-2无活性。,重组IL-2可用6 mol/L盐酸胍或8 mol/L尿素使包涵体变性解聚成单分子，再利用空气氧化或用1.5 mol/L还原型谷胱甘肽复性。恢复IL-2二硫键和正常分子结构，获得生物活性。,重组IL-2的进一步纯化有如下几种方法,利用IL-2的疏水性，经超滤浓缩后利用反相高效液相层析和较高浓度的乙腈（60%）的流动相进行梯度洗脱，可得高纯度的IL-2。,通过受体亲和层析一步纯化，可得到纯度为95%以上的IL-2。,用7 mol/L尿素溶解IL-2包涵体得到上清夜，上清液经Sephadex G-100凝胶过滤和W650蛋白质纯化洗脱DEAE离子交换层析，最终得到均一的IL-2，纯度达到98%。,