细胞免疫荧光技术(课堂PPT).ppt

单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞免疫荧光技术,1,实验目的,掌握免疫荧光技术的基本原理,熟悉细胞免疫荧光技术的方法,了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果,2,实验原理,原位检测,抗原抗体特异反应,间接法,间接荧光抗体染色法示意图,抗原,抗体,荧光素标记的抗抗体,激发光,显示荧光,Hela,细胞,Vinculin,3,实验用品,试剂：,固定液：,4%PFA,细胞通透：,0.2%TritonX,封闭试剂：,10%,正常山羊血清,一抗：小鼠源抗,Vinculin,单克隆抗体,二抗,:Alexa Fluor555,标记的山羊抗小鼠,IgG,DAPI,（,4,6-,二脒基,-2-,苯基吲哚）,PBS,洗涤缓冲液：,PH7.4,材料：,Hela,细胞,细胞培养皿,仪器：,荧光显微镜,4,实验步骤,一，细胞制备和细胞固定,将细胞铺在,24,孔板中,将细胞培养,至所需密度,加入,4%PFA,固定,10min,染色,或保存,PBS,洗涤,PBS,洗涤,5,实验步骤,二，细胞免疫荧光,ICC,染色,0.2%,TritonX,处理,5min,封闭,室温,30min,4,过夜,37,1-2,小时,37,5-10min,荧光显微镜观察,加入一抗,加入二抗,加入,DAPI,复染,PBS,洗涤,PBS,洗涤,PBS,洗涤,6,实验结果,三，观察,human HeLa cells,7,实验中应注意的问题,细胞不要铺的过密,:60-70%,防止细胞污染,固定时间不要太长,一般,10-30min,TrionX,处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理,选择合适的封闭液,二抗孵育后,一定要洗干净,必要时用恒温摇床摇洗,8,1.,免疫荧光技术,2.,免疫酶技术,3.,免疫亲和技术,4.,胶体金技术,标记物,使抗体或抗原,抗体复合物在,各种显微镜下,可见的物质,免疫细胞化学技术,9,免疫细胞化学技术注意事项,选择合适的方法,材料要留好,选择抗体,选择标记酶,封闭液的选择,设定对照实验,10,思考题,检测,Hela,细胞中蛋白,A,定位情况，思考应选择什么方法，,用什么仪器观察？,A,11,疑难解答,一，缺乏染色,可能的原因,无抗原,抗体失效,固定不充分,过度固定,抗原修复无效,不兼容的二抗和一抗,漏用试剂或未按正确的顺序,加入试剂,相应的措施,用原位杂交方法检测蛋白表达,按说明书储存抗体,;,分装抗体,;,避免反复冻融,增加固定时间或改用不同的固定剂,减少固定时间,;,抗原修复,增加修复时间或更换修复液,使用可以与一抗结合的二抗,重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序,12,二，高背景,13,可能的原因,一抗或二抗的浓度过高,一抗和,/,或二抗与组织的,非特异性结合,组织过于干燥,试剂粘附在旧的,或未制备好的玻片上,相应的措施,预实验摸索最佳浓度,一抗孵育前封闭,(,最好是二抗来源的血清,),在染色过程中避免组织干燥,用新鲜制备或购买的玻片进行实验,14,三，细胞,/,组织的形态被破坏,15,可能的原因,抗原修复方法过于剧烈,组织切片从玻片上脱落,组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡,组织形态难以分辨,组织固定不充分,自发裂解,相应的措施,预实验摸索合适的修复条件,增加固定时间,;,烤片,;,使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片,使用锋利的刀片,;,分析时避开受损的区域,切片薄一些,;,冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水,及时固定,;,增加固定时间,;,提高固定剂,/,组织的比例,;,将组织切得较小,16,四，染色不正确,可能的原因,固定方法对于抗原不合适,抗原修复方法不合适,没有及时固定引起抗原的扩散,相应的措施,尝试不同的固定剂或增加固定时间,尝试改变抗原修复条件,立即固定组织,;,尝试用交联性固定剂替换,有机,(,醇类,),固定剂,17,