微生物学实验(详细介绍).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,微 生 物 学 实 验,淮海工学院,海洋学院,.,课程组人员,:,王淑军 暴增海 马桂珍,王洪斌 陈静,制作人员,:,马桂珍 暴增海,.,课 程 简 介,微生物学实验课是微生物学课程教学中的一个重要环节。本课程总计,36,学时，使用教材是沈萍主编的,微生物学试验,（第三版）。通过本课程的学习，使学生了解微生物学的基本知识；巩固和加深所学理论知识；掌握微生物学最基本的操作技能。同时，通过实验，培养学生培养学生独立思考和理论联系实际能力；养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素质修养。,.,实验一,显微镜使用及微生物形态观察,实验二 霉菌形态特征,实验三 细菌革兰氏染色及特殊结构观察,实验四 微生物的测微技术,实验五 酵母菌形态观察和死活细胞鉴别,实验六 玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌,实验七 培养基的配制和灭菌,实验八 微生物分离纯化及观察,实验九 显微镜直接计数法,实 验 内 容,.,实验十 平板菌落计数法,实验十一 微生物生长曲线的测定,实验十二 理化及生物因素对微生物生长 的影响,实验十三 微生物的生理生化反应特性,实验十四 微生物菌种保藏技术,.,显微镜概述,微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握不同显微镜的使用方法是很有必要的。,显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。,实验一,显微镜使用及微生物形态观察,.,一、目的要求,1.,学习显微镜的结构、功能和使用方法。,2.,学习并掌握油镜的原理和使用方法。,.,基础知识,尼康,E-600,显微镜,二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理,普通生物显微镜由,3,部分构成：,照明系统：包括光源和聚光器。,光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。,机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台,(,载物台,),、调节器和、物镜转换器,(,旋转器,),。,8,.,与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间加滴镜油，原因有二：,1.,增加照明亮度,油镜的放大倍数可达,100 x,，教具很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。为了不使通过的光线有所损失，必须造又精于加入与玻璃的折射率（,n=1.55,）相仿的镜油。通常用香柏油（,n=1.52,）,.,2.,增加显微镜的分辨率 油镜的分辨率可达到,0.2,m,左右。,.,2.,荧光显微镜,尼康,E800,荧光,DIC,显微镜,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,.,3.,激光共聚焦扫描显微镜,LCSM,照片,蓝色为细胞核，绿色为微管,.,4.,暗视野显微镜,暗视野显微镜（,dark field microscope,）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至,4-200nm,的微粒子，分辨率可比普通显微镜高,50,倍。,一种介壳虫的染色体,.,5.,相差显微镜,6.,偏光显微镜,偏光显微镜（,polarizing microscope,）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。,.,7.,微分干涉差显微镜,DIC,显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,DIC,显微镜下的硅藻,（伪彩色）,.,8.,倒置显微镜,.,9.,透射电子显微镜,JEM-1011,透射电子显微镜,莱卡超薄切片机,.,内质网透射电镜图（伪彩色）,冰冻蚀刻电镜照片,.,10.,扫描电子显微镜,JEOL,扫描电子显微镜,人类血细胞,SEM,照片,.,11.,显微操作技术,尼康,NT-88NE,显微操作,/,注射仪,.,显微镜的分辨率,:,也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离，,分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨,距离来表示的。,其计算公式为,:D=0.61,入,/NA NA=n sina/2,式中,D,为分辨率，,A,为光波波长，,NA,为物镜的数值孔径,(,镜口率,),。,.,在物镜上，有镜口率,(N.A.),的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：,物镜 镜口率,(N.A.),工作距离,(mm),10 0.25 5.40,40 0.65 0.39,100 1.30 0.11,.,显微镜的总放大倍数,等于目镜和物镜放大倍数的乘积，,公式为,:M=K1xK2,焦点深度,:,显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的,上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察,。,.,厚标本和薄标本,4-5 um,2um,基础知识,.,三、实验步骤,(,一,),显微镜的使用,1.,观察前的准备工作,(1),观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。,(2),观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。,(3),显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。,.,瞳 距 调 节,2.,显微镜的调节,.,屈 光 度 调 节,调节,.,粗 调 松 紧 调 节 旋 钮,.,聚 光 镜 中 心 调 节,光轴中心调节螺钉,视场光栏,孔径光栏,10X,物镜,标本,聚光镜升降旋钮,.,孔径光栏调节,N.A,聚,=,(,0,.,6-0,.,8,)N.A,物,.,孔径光栏开度与图象,100%,70%,30%,.,孔径光栏的运用,.,操作步骤如下,:,(1,）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整,;,如果可变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。,(2),载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平面稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低倍物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和最均匀 的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中央。,(3),转到高倍镜，并调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出目镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变 光栏关小，看其亮点是否在视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点调到视野中 央，再慢慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和聚光镜的边缘相接为止。,.,3.,观察操作,(1),低、高倍镜的使用,:,先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片,0.5cm,处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。,.,1.,不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。,2.,镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度,3.,观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。,4.,拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。,5.,显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片,。,四、显微镜保养和使用中的注意事项,.,五、记录实验结果,绘图,.,六、思考题,1.,使用油镜时，为使么选用香柏油或液体石蜡作为物镜与玻片间的介质？其他液体行吗？,2.,油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？用过多的二甲苯或用酒精擦镜有什么危害？,3.,什么是物镜的同焦现象？他在显微镜观察中有什么意义？,4.,观察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开？,.,一、实验目与基本要求：,学习并掌握观察霉菌形态的基本方法，了解常见霉菌的基本特征。,二、实验内容：,1,观察霉菌菌落形态。,2,用显微镜观察霉菌装片。,3,制作霉菌装片并观察其形态。,实验二 霉菌形态特征,.,三、实验步骤,（一）菌落特征的观察,用肉眼观察生长在琼脂平板上的各种霉菌菌落，并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。,1.,菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和高度。,2.,菌落的颜色：正面和背面的颜色，培养基的颜色变化。,3.,菌落的形态：棉絮状、网状、疏松或紧密、同心轮纹、放线状的皱褶等。,.,霉,菌,菌,落,各种曲霉的菌落,各种病原真菌的菌落,.,青霉的菌落,青霉的菌落,霉菌菌丝,A,、无隔菌丝,B,有隔菌丝,隔膜,.,（二）个体形态特征的观察,1.,乳酸石炭酸制片法观察（,1,）制片：在干净的载玻片上加一滴乳酸石炭酸，用接种针从菌落边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液体中，再小心地把菌丝放开，然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。,.,（,2,）镜检：,1,）毛霉和黑根霉的孢子的形状、颜色、大小、孢子囊、中轴体的形状，有无假根和葡萄菌丝。,2,）黑曲霉的分生孢子的形状、颜色、大小、顶囊的形状、小梗排列隔膜。,3,）青霉的分生孢子的形状、颜色、大小、小梗的排列方式，菌丝的隔膜。,.,（,3,）将观察结果绘图，并注意各部分名称。,霉菌的静孢子左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出静孢子；右：囊轴,.,曲霉的分生孢子梗和顶囊上的分生孢子,青霉的帚状分生孢子梗和分生孢子,曲霉的分生孢子头彩图,霉菌的厚垣孢子,.,2.,插片培养观察：（,1,）插片培养：将已灭菌的盖玻片斜插入培养基平板上，一半露在外面，然后沿盖玻片与培养基交接处接种霉菌孢子悬液。,24,到,26,度恒温培养,2,到,4,天。（,2,）制片、镜检：以无菌操作取下盖玻片，有菌面朝下，放在滴有一滴棉兰染液的载玻片上。,.,四、实验报告,绘制镜检形态图,1,毛霉和根霉形态图，示各部。,2,青霉和曲霉形态图，示各部,五、问题和思考,1,什么叫载玻片湿室培养,?,它适用于观察怎样的微生物，有何优点,?,2,湿室培养时为何用,20%,甘油作保湿剂,?,.,（一）实验目的,（二）实验原理,（三）实验器材,（四）实验方法,（五）注意事项,（六）实验作业,实验三 细菌革兰氏染色及特殊结构观察,.,革兰氏染色,（一）实验目的,1,、学习微生物涂片、染色的操作技术；,2,、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；,3,、初步掌握无菌操作技术；,4,、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。,.,（二）实验内容及原理,1.,简单染色法,是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红 等）使其着色。,.,Simple stains,.,2.,革兰氏染色法,是,1884,年由丹麦病理学家,C.Gram,所创立的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（,G,+,）和革兰氏阴性菌（,G,-,）两大类。,.,1,2,3,4,？,结晶紫,碘液,酒精,复红,.,革兰氏染色的机理：,主要由于两类细菌的,细胞壁成分和结构不同,。,.,.,1,、菌种：,培养,12-16h,的枯草杆菌（,Bacillus subtilis,），培养,24,小时的大肠杆菌（,Escherichia coli,）,2,、染色液和试剂：,草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、,95%,酒精、蕃红染液、复红、乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水,3,、器材：,废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。,（三）实验器材,.,1,、简单染色,(,四）实验方法：,制片染色水洗干燥镜检,（,1,）制片：,取菌种培养物,常规涂片,、自然干燥、加热固定；,注意无菌操作,.,（,2,）染色：,将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色,1-2min,。,（,3,）水洗：,用水洗去涂片上的染色液。,（,4,）干燥：,将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。,（,5,）镜检：,先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。,.,2,、革兰氏染色,制片,初染,（结晶紫,1min,）,水洗,媒染,（碘液,1min,）,水洗,脱色,（乙醇,20-30s,）,水洗,复染,（番红,2min,）,水洗干燥观察,.,crystal violet stain wash with water,Stain with grams iodine solution,Decolorize by adding 95%alcohol,.,革兰氏阴性杆菌,革兰氏阳性杆菌,Counterstain with Safranin,.,将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：,a.,先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。,b.,用擦镜纸沾少许,乙醚,-,乙醇混合,液将镜头擦,2-3,次。,c.,再用干净的擦镜纸将镜头擦,2-3,次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。,观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。,（,10,）实验完毕后的处理,.,1,、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。,2,、革兰氏染色成败的关键是,酒精脱色,。,？,（五）注意事项,3,、染色过程中勿使染色液干涸。,4,、选用幼龄的细菌。,.,（六）实验作业,绘出,枯草杆菌,和,大肠杆菌,的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。,1,你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？,2,当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？,.,.,（一）实验目的,1,、继续学习微生物标本的制作方法；,2,、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法,;,3,、巩固无菌操作技术。,细菌的芽孢和荚膜染色,.,（二）实验原理,芽孢、荚膜染色法都是利用细菌各部位（分）的构造不同，它们对染料的亲和力也不同。因此，可以采用各种特殊染色方法，使细菌细胞的不同构造能在显微镜下显示出来，便于观察和区别。,.,芽孢,又称内生孢子（,endospore,），是某些细菌（革兰氏染色阳性杆菌）生长到一定时间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的结构。,.,芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。,.,中央芽孢,偏端芽孢,游离芽孢,末端芽孢,.,芽孢染色原理,芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难，当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大的复染色剂（蕃红液）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢和菌体更易区分。菌体呈红色而芽孢呈绿色。,.,荚膜,是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。,荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬,。,.,荚膜染色原理,由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。通常用,负染色法,染色，,使细菌和背景着色，背景与菌体之间形成一透明区即荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变形，在制片是一般不用加热固定。,.,1,、菌种：,蜡样芽孢杆菌约,2 d,营养琼脂斜面培养物；褐球固氮菌,(,Azotobacter chroococcus,),约,2 d,无氮营养基琼脂斜面培养物。,2,、染色液和试剂：,5,孔雀绿水溶液、,0.5,蕃红溶液、碳素墨水、甲醇、生理盐水等；,3,、器材：,试管夹、酒精灯、接种针、载玻片、显微镜、香柏油、乙醚酒精、擦镜纸等。,（三）实验器材,.,制片,染色,（孔雀绿,5min,）,水洗,复染,（蕃红花红,2-3min,）,水洗干燥镜检,1,、芽孢染色,(,四）实验方法：,切勿煮干,.,芽孢染色结果,（芽孢呈绿色，营养体及芽孢囊呈红色）,.,2,、荚膜染色,（湿墨水法）,（,1,）制备菌和墨水混合液：,加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌与之充分混合均匀；,（,2,）加盖玻片：,将一洁净盖波片盖在混合液上，然后在盖波片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液；,（,3,）镜检：,用低倍镜和高倍镜观察。,.,荚膜染色结果,背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。,.,1,、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。,2,、染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂片干涸。,3,、荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。,4,、涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏其荚膜原形。,（五）注意事项,.,（六）实验作业,1,绘出表示,芽孢杆菌,的形态特征，注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形态特征。,2,绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。,.,1,若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因,?,2,组成荚膜的成分是什么,?,涂片一般用什么固定方法，为什么,?,.,.,一、目的要求,学习和掌握用测微尺测量微生物细胞大小的方法,实验四 微生物的测微技术,.,二、基本原理,微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具即测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。,.,三、实验材料,酵母菌液,显微镜、血球计数器、目镜测微尺、镜台测微尺,3.,载玻片、盖玻片、接种环、胶头吸管等,.,四、实验内容,1.,测微尺的校正（标定）：,两重合线间镜台测微尺格数,10,目镜测微尺每格长度,(m)=,两重合线间目镜测微尺格数,2,酵母菌大小的测定：,利用制好的血球器浸片，用高倍镜测出宽和长各占目镜测微尺的格数，再将测到的格数乘以目镜测微尺（用高倍镜时标定的）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。,注意事项：,观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台测微尺的刻度,;,换高倍镜和油镜校正时,务必十分小心,防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。,.,五、实验报告,将目镜测微尺校正结果填入下表,:,接目镜放大倍数：,-10-,.,五、实验报告,将酵母菌大小测定结果填入下表：,思考题：,为什么更换不同放大倍率目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重,新对目镜测微尺进行校正？,.,实验五,酵母菌的形态,观察及死活细胞的鉴别,（一）实验目的,（二）实验原理,（三）实验器材,（四）实验方法,（五）注意事项,（六）实验作业,.,（一）实验目的,1,、观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式；,2,、学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法；,3,、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。,.,（二）实验原理,酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物。,无性繁殖主要是,出芽生殖,。,.,本实验通过用,美蓝染色浸片,来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。,.,美蓝（氧化型）,蓝色,美蓝（还原型）,无色,还原剂,氧化剂,美蓝,是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色。,.,死活细胞鉴别原理,美蓝（氧化型）,蓝色,美蓝（还原型）,无色,酵母活细胞,新陈代谢,还原能力,.,1,、菌种：,酿酒酵母（,Saccharomyces cerevisiae,）培养约,2d,的麦芽汁斜面培养物；,2,、染色液和试剂：,0.05,和,0.1%,吕氏碱性美蓝染液；,3,、器材：,废液缸、载玻片、盖玻片、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。,（三）实验器材,.,在载玻片中央加一滴,0.1,吕氏碱性美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均匀；,用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上；,(,四）实验方法,（美蓝浸片）,染液不宜过多或过少,盖玻片不宜平着放下,.,将制片放置约,3min,，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。,染色,30min,后再次观察，注意死活细胞数量的变化；,用,0.05,的吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。,.,1,、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察；,2,、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。,（五）注意事项,.,（六）实验作业,绘图说明你所观察到的酵母菌的细胞结构及出芽生殖方式。,1,、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。,2,、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？,.,一,、实验目的,1.,掌握玻璃器皿的洗涤和包扎方法；,2.,了解玻璃器皿的灭菌方法和原理。,实验六 玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌,.,二、实验原理,微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎。,.,三、实验器材,试管、培养皿、吸管、棉花、包扎绳、三角瓶、电热烘箱等。,.,四、操作步骤,（一）、玻璃器皿的洗涤方法,1,、新玻璃器皿的洗涤,在,2%,的盐酸溶液中浸泡数小时，用自来水冲洗干净。,2,、旧玻璃器皿的洗涤,（,1,）试管、培养皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自来水冲洗,.,装有固体培养基：刮掉，洗涤,带菌的器皿：,2%,来苏尔或,0.25%,新洁尔灭消毒液中浸泡,24,小时或煮沸,0.5,小时，然后洗涤,带病原菌培养物的器皿：先高压蒸汽灭菌，倒去培养物后在洗涤,.,（,2,）玻璃吸管：吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，反复冲洗,吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自来水的容器中浸泡，实验后集中冲洗。,塞有棉花的吸管：用水将棉花冲出，然后冲洗,吸过含有微生物培养物的吸管：,2%,来苏尔或,0.25%,新洁尔灭消毒液中浸泡,24,小时然后洗涤,吸管内壁有油垢：洗涤液中浸泡数小时，再冲洗,.,（,3,）载玻片与盖玻片,带有香柏油：用皱纹纸擦或在二甲苯中摇晃几次，然后在肥皂水中煮沸,5-10,分钟，用软布或脱脂棉擦拭，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡,0.5-2,小时，自来水冲洗，干后在,95%,乙醇中保存备用。,检查过活菌的：,2%,来苏尔或,0.25%,新洁尔灭消毒液中浸泡,24,小时然后按上述方法洗涤。,.,（二）、玻璃器皿的包扎,1,、培养皿的包扎：一般以,5-8,套培养皿做一包,2,、吸管的包扎：准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约,0.5cm,处，塞一小段,1.5cm,长的棉花，然后将吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸成,30,度角，并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打一小结。,3,、试管和三角瓶等的包扎：试管口和三角瓶口用棉花塞或泡膜塑料塞，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用二层报纸与细线扎好。,.,（三）、灭菌,采用干热灭菌法。,A,、原理：利用干的热空气使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,B,、操作方法：装入待灭菌物品关门升温恒温降温开箱取物。,C,、灭菌条件：,160-170,，,1-2,小时。,五、结果记录 （略）,六、思考题,玻璃器皿干热灭菌时应该注意哪些问题，为什么？,.,（一）实验目的,（二）实验原理,（三）实验器材,（四）实验方法,（五）实验作业,实验七 培养基的配制和灭菌,.,（一）实验目的,1,、明确培养基的配制原则；,2,、掌握配制培养基的一般方法和步骤；,3,、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；,4,、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。,.,（二）实验原理,培养基,是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基,.,培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基,.,常用加热灭菌法,：,1,、干热灭菌：,用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌,2,、湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,间歇灭菌法,煮沸消毒法,灭菌,是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。,.,（三）实验器材,1.,药品和试剂：,牛肉膏、蛋白胨、,NaCl,、,10,NaOH,溶液、,10,盐酸溶液。,2.,器材：,天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、,PH,试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、线绳、干燥箱、高压锅。,.,1.,称量,按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。,配方：牛肉膏,5.0g,蛋白胨,10.0g,，,NaCl5.0g,琼脂,20.0g,蒸馏水,1000ml,pH7.0,。,（四）实验方法,培养基的制备过程,称量,-,溶解,-,调节,pH,值,-,过滤,-,分装及包扎,-,灭菌,-,灭菌后试管摆放斜面,.,2.,溶解,向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。,3.,调节,pH,值,用玻璃棒沾少许液体，测量,PH,值。用氢氧化钠和盐酸调节,PH,。,.,4.,过滤,用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。,5.,分装及包扎,根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。,.,6.,灭菌：,高压蒸汽灭菌，,121,0,C,灭菌,20,分钟。,.,7.,灭菌后试管摆放斜面,.,.,.,注 意 事 项,1,、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；,2,、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；,2,、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；,4,、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的,1/5,，液体培养基的装量约为管高的,1/4,，三角瓶的装量不超过瓶体的,1/2,；,5,、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。,返 回,.,（五）实验作业,1.,思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养基？,2.,为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？,.,（一）实验目的,（二）实验原理,（三）实验器材,（四）实验方法,（五）实验作业,实验八 微生物分离纯化及观察,.,（一）实验目的,1,、了解微生物分离和纯化的原理,2,、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术，掌握微生物的无菌操作技术。,.,（二）实验原理,在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。,为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条件要求不同，从而制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。,.,（三）实验器材,1.,样品,土样,2.,培养基,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、豆芽汁培养基。,3.,其它,盛,9ml,无菌水的试管、盛,90ml,无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿。,.,（四）实验方法,（一）、稀释混合平板法,图,14-1,从土壤中分离微生物操作过程,.,（,1,）土壤稀释液的制备,称取土样,10g,，放入盛,90ml,无菌水三角瓶中，振荡,15,20,分钟，使微生物细胞分散，静置约,20,30,秒，即成,10-1,的土壤悬液。,.,另取装有,9ml,无菌水的试管，编号为,10,-2,、,10,-3,、,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,及,10,-7,，用无菌吸管吸取,10,-1,土壤悬液,lml,，加入编号,10,-2,的无菌试管中，吹吸三次，使之混合均匀，即成,10,-2,的土壤稀释液。再用另一支吸管吸取,10,-2,试管中的土壤稀释液,1ml,，加入编号,10,-3,的无菌试管中，轻轻摇动，使之混合均匀，即成,10,-3,的土壤稀释液，一定要每次更换一支无菌吸管（连续稀释）。同法依次分别稀释成,10,-4,、,10,-5,和,10,-6,等一系列稀释度菌悬液,.,（,2,）平板制作,将无菌培养皿编上,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,号码，每一号码设三个重复，用,1ml,无菌吸管按无菌操作要求吸,10-6,稀释液各,1ml,，分别放入编号,10,-6,的三个培养皿中。同法吸取,10,-5,稀释液各,1ml,，分别放入编号,10,-5,的三个培养皿中。再吸取,10,-4,稀释液各,1ml,，分别放入编号,10,-4,的三个培养皿中。然后在,9,个培养皿中分别倒入,15ml,已融化并且冷却至,45,左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，整个操作过程应严格按照无菌操作,.,.,（,3,）培养与移植,待平板完全冷凝后，将平板倒置,37,恒温箱中培养,24,48,小时，检查分离结果。将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上，然后置于,37,恒温箱中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其它杂菌混杂，就可再一次进行分离、纯化，直至获得纯培养。,.,（二）稀释涂布平板法,此法与稀释混合平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先将牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马丁氏培养基融化，在火焰旁注入培养皿，摇匀后制成平板，然后用三支,1ml,无菌吸管分别由,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,三管土壤稀释液中各吸取,0.2ml,对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，然后分别倒置于,28,和,37,温箱中培养后，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。,.,（三）平板划线分离法,交叉划线法 连续划线法,.,（五）实验作业,1,在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。,2,稀释分离时，为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到,45,50,左右才能倾入到装有菌液的培养皿内？,3,划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？,4,培养时为什么要将培养皿倒置培养？,.,（一）实验目的,（二）实验原理,（三）实验器材,（四）实验方法,（五）实验作业,实验九 显微镜直接计数法,.,（一）实验目的,1,、了解显微镜计数的原理；,2,、学习并掌握使用血球计数板进行微生物直接计数的方法。,.,（二）实验原理,利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称为总菌计数法。,.,血球计数板,是一块特制的载玻片，其上四条纵槽构成了三个平台，中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分成,9,个大方格，中央的大方格为计数室。计数室边长,1mm,，共有,400,个小方格，加盖玻片于突起部分上时，即形成一个体积为,0.1mm,3,的计数室。,计数室的规格有两种：一种是,25,个中方格,16,个小格，另一种是,16,个中方格,25,个小格，所以小方格的总数是相同的，都为,400,个。,.,.,在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上,16,或,25,，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成,1ml,菌液中的总菌数。如果设五个中方格的总菌数为,A,，菌液稀释倍数为,B,，那么，一个大方格中的总菌数即（,0.1mm3,中的总菌数）为,A,5 16(,或,25)B,。所以,1ml,菌液中的总菌数,=A,516,（或,25,）,101000B,。,.,（三）实验器材,1.,菌种,酿酒酵母（,Saccharomyces cerevisiae,）菌悬液,2.,器具,显微镜、血球计数板、酒精灯、接种环、无菌水、吸管、盖玻片、计数器,。,.,（四）实验方法,1.,稀释,将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。,2.,镜检计数室,在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。,.,3,加样品,将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多）让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。,.,4.,显微镜计数,静置几分钟，将计数板放在显微镜下，先用低倍镜找到计数室，再换成高倍镜进行计数；每个计数室选右上右下、左上左下和中间的五个中方格中的菌体进行计数，每个样品重复计数两次,5.,清洗血球计数板,计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净后自行晾干或用吹风机吹干，镜检观察每小格内无残留物为止。,.,注意事项,1,、加样时先摇匀菌液，计数室中不可有气泡产生；,2,、计数时，格线上的菌体只数上方和右边线上的；,3,、如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，作为两个菌体计算；,4,、清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。,.,计,数,室,各格中菌数,总,菌,数,稀,释,度,菌,数,/ml,平均值,1,2,3,4,5,第一室,第二室,显微直接计数结果,(,五,),、作业,.,实验十 平板菌落计数法,一、实验目的,学习平板菌落计数的基本原理和方法。,二、实验原理,平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即*一个单菌落应代表原样品中的含菌数。,.,三、实验器材,1,、菌种：酵母菌菌悬液,2,、培养基：,PDA,其他：,1ml,无菌吸管，无菌平皿、无菌水、试管架、恒温培养箱,.,四、实验步骤,1,、倒平板：每皿约,15ml,，,2,、编号：对平板和稀释用试管分别编号。,3,、稀释：放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。,4,、取样：选择合适的三个稀释度，用三支无菌吸管分别吸取三个稀释度的菌悬液，对号放入编好号的无菌平皿中。不要用,1ml,吸管每次只靠吸管尖部吸,0.2ml,稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。,.,5,、涂布：用灭过菌的涂布棒将菌悬液均匀涂布在平皿表面。涂完后，旋转,90,度再涂布。,以上倒平板、稀释、涂布均要进行无菌操作,6,、计数：培养,48,小时后，取出培养平板，一般选择每个平板上有,30300,个菌落的稀释度计数。算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式计算：,每毫升中菌落形成单位（,cfu,）,=,同一稀释度三次重复的平均菌落数,稀释倍数,5,.,.,五、结果记录,稀释度,10-510-610-7123,平均,123,平均,123,平均,Cfu,数,