药物的定量分析与分析方法的验证.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章,药物定量分析与分析方法验证,药物分析教研室,1,.,Contents,定量分析样品的前处理方法,1,定量分析方法的特点,2,药物分析方法的验证,3,生物样品分析方法的基本要求,4,2,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,Pretreatment of sample used in quantitative analysis,一、概述,含卤素药物,CX,乙烯型卤和芳卤,烯丙型卤和苄卤,卤代烷型,卤素活泼性,I,Br,Cl,F,分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强；同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显,3,.,三氯叔丁醇,六氯对二甲苯,泛影酸,碘他拉酸,第一节 定量分析样品的前处理方法,4,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,不经有机破坏,经有机破坏,直接测定,配位滴定法,氧化还原滴定法,水解后测定,碱水解,酸水解,经还原分解后测定,湿法破坏,凯氏定氮法,干法破坏,高温灼烧法,氧瓶燃烧法,5,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,(,一,),、直接测定法,葡萄糖酸钙,EDTA,配位滴定,富马酸亚铁 邻二氮菲,-,硫酸铈滴定,葡萄酸锑钠 间接碘量法,(,二,),、经水解后测定法,适用范围：,金属原子不直接于碳原子相连或某些,C-M,键结合不牢固的有机金属药物。,6,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,1,、碱水解法,三氯叔丁醇,银量法,返滴定,2,、酸水解法,适用范围：,含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物。,EDTA,配位滴定,7,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,(,三,),、经还原分解后测定法,适用范围：,碘原子直接与芳环连接的含碘有机化合物。,8,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,三、经有机破坏的分析方法,含氮、硫、硫柳汞、氯化钠的生物制品、含氮有机合成药物测定的前处理和生物制品中金属元素测定时生物基质的去除。,H,2,SO,4,-HNO,3,H,2,SO,4,-HClO,4,H,2,SO,4,-H,2,SO,4,HNO,3,-KMnO,4,分解剂,/,消化剂,辅助分解剂,凯氏定氮法,测定含有氨基和酰胺结构的药物结构,(,一,),湿法破坏,9,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,原 理,将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被,“,消化,”,成,CO,2,和,H,2,O,，有机结合的氮转化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。,常量法,含氮量,25,30mg,半微量法,含氮量,1.0,2.0mg,10,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,凯氏烧瓶,K,2,SO,4,(,提高消解温度,),CuSO,4,(,加快消解速度,),硫酸,碱液,硼酸,(,吸收液,),甲基红,-,溴甲酚绿指示剂,硫酸滴定,空白校正,11,.,(,二,),干法破坏,1.,高温灼烧法,用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。,常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。,2.,氧瓶燃烧法,第一节 定量分析样品的前处理方法,系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭的密闭的燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为,CO,2,和,H,2,O,，待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，再根据其性质和存在方式选择方法进行分析。,12,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,13,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,14,.,第一节 定量分析样品的前处理方法,示例 碘苯酯的含量测定,取本品约,20mg,，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用,NaOH,T.S.2ml,与,H,2,O,10ml,为吸收液，待吸收完全后，加,溴醋酸,溶液,10 ml,，密塞，振摇放置数分钟，加,甲酸,约,1ml,，用水洗涤瓶口，并通入空气流约,35min,，以除去剩余的溴蒸气，加,KI,2g,，密塞，摇匀，用,Na,2,S,2,O,3,液,(,0.02mol/L,),滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。,每,1ml,的硫代钠液,(,0.02mol/L,),相当于,1.388mg,的,C,19,H,29,IO,2,。,15,.,C,19,H,29,IO,2,分子量为,416.34,C,19,H,29,IO,2,6 Na,2,S,2,O,3,滴定度,(T)=,416.341/60.02=1.338(,mg,),第一节 定量分析样品的前处理方法,16,.,第二节 定量分析方法的特点,一、容量分析方法,1.,滴定度,每,1ml,规定浓度的滴定液所相当的被测药物浓度。,被测药物,滴定液,17,.,第二节 定量分析方法的特点,18,.,第二节 定量分析方法的特点,示例一,Vc,的含量测定,碘量法测定,Vc,含量,M(C,6,H,6,O,6,)=176.13,，,C(I,2,)=0.05mol/L,示例二,异烟肼的含量测定,溴酸钾法测定,异烟肼,含量,M(C,6,H,7,N,3,O)=137.14,，,C,溴酸钾,=0.01667mol/L,19,.,第二节 定量分析方法的特点,示例三,葡萄糖酸锑钠的含量测定,0.3g,供试品,水,100ml,盐酸,15ml,碘化钾试液,10ml,密塞，振摇后暗处放置,10min,碘量法,Sb,5+,2S,2,O,3,2-,20,.,示例四,司可巴比妥钠的含量测定,第二节 定量分析方法的特点,取本品约,0.1g,，,精密称定,，置,250ml,碘瓶中，加水,10ml,，振摇使溶解，,精密加溴滴定液,(,0.05mol/L,),25ml,，再加盐酸,5ml,，立即密塞，并振摇,1min,，在暗处放置,15min,后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液,10ml,，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液,(,0.1mol/L,),滴定，至终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定得的结果用空白试验校正。,M=260.23,司可巴比妥,溴,=1:1,W=0.1022 g,；,F=1.038,；,V=15.73ml V,0,=23.21,21,.,第二节 定量分析方法的特点,习题一 剩余碘量法测定异烟肼含量,异烟肼在弱碱性溶液中，加定量过量的碘滴定液,(0.1mol/L),氧化，反应完成后，酸化，剩余碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液,(0.1mol/L),滴定,(,以淀粉为指示剂,),。,22,.,第二节 定量分析方法的特点,习题二 非那西丁含量测定,精密称取本品,0.3630g,加稀盐酸回流,1,小时后，放冷，用亚硝酸钠液,（,0.1010mol/L,）,滴定，用去,20.00ml,。每,1ml,亚硝酸钠液,（,0.1mol/L,）,相当于,17.92mg,的,C,10,H,13,O,2,N,，请计算非那西丁的含量。,23,.,第二节 定量分析方法的特点,二、光谱分析法,(,一,),紫外,-,可见分光光度法,仪器校正,空白溶剂校正,吸收峰波长确定,A,(0.30.7),24,.,第二节 定量分析方法的特点,含量测定方法,1.,对照品比较法,原料药,制剂,25,.,2.,吸收系数法,习题一 维生素,B2,含量测定,取本品,75mg,，精密称定，置烧杯中，加冰醋酸,1ml,与水,75ml,，加热溶解后，加水稀释，放冷，移置,500ml,量瓶中，加水稀释至刻度，混匀；精密量取,10ml,，置,100ml,量瓶中，加,1.4%,醋酸钠溶液,7ml,，并用水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法在,444nm,的波长处测吸收度，按维生素,B2,的吸收系数 为,323,计算,第二节 定量分析方法的特点,26,.,第二节 定量分析方法的特点,3.,计算分光光度法,4.,比色法,27,.,特点：,灵敏度高，可达,10,-10,10,-12,g/ml,要求低浓度下测定,须做空白测定,荧光弱的药物可衍生化后测定,第二节 定量分析方法的特点,(,二,),荧光分析法,28,第二节 定量分析方法的特点,(,三,),色谱分析法,1.HPLC,示例一 炔诺酮的含量测定,照高效液相色谱法,(,附录,D,测定,),色谱条件与系统适用性试验,用,十八烷基硅烷键合硅胶,为填充剂；以甲醇,-,水,(65:35),为流动相，检测波长为,244nm,。,理论塔板数,按炔诺酮峰计算不低于,1500,，炔诺酮峰与内标物质峰的,分离度,及主成分峰后一杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要求。,内标溶液的制备,取黄体酮约,25mg,，精密称定，置,25ml,量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。,29,.,第二节 定量分析方法的特点,测定法,取本品约,25mg,，精密称定，置,25ml,量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液,2ml,与内标溶液,3ml,，置,10ml,量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取,20,l,注入液相色谱仪，记录色谱仪，记录色谱图；另取炔诺酮对照品适量，精密称定，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。,30,.,2.GC,第二节 定量分析方法的特点,示例 松节油的含量测定,照气相色谱法,(,附录,E,测定,),色谱条件与系统适用性试验,用聚乙二醇,(PEG)-20M,为固定相，涂布密度为,20%,；柱温为,90,C,。理论塔板数按,-,蒎烯峰计算应低于,1500,。,校正因子测定,取正丁醇适量，精密称定，加石油醚,(30,60C),制成每,1ml,含,20mg,的溶液，作为内标溶液。另取,-,蒎烯对照品约,30mg,，精密称定，置,10ml,棕色量瓶中，精密加入内标溶液,2ml,，加石油醚,(30,60C),至刻度，摇匀，吸取,1,l,注入气相色谱仪，计算校正因子。,31,.,第二节 定量分析方法的特点,测定法,取本品约,35mg,，精密称定，置,10ml,棕色量瓶中，精密加入内标溶液,2ml,，用石油醚,(30,60C),溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取,1,l,注入气相色谱仪，测定，即得。,本品含,-,蒎烯,(C,10,H,16,),不得少于,70%,。,32,.,第三节 药品分析方法的验证,药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验,指导原则,药物稳定性试验,指导原则,缓释、控释制剂,指导原则,微囊、微球与脂质体制剂,指导原则,细菌内毒素检查法应用,指导原则,目的：,证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求,效能指标：,评价分析方法的尺度,效能指标包括,:,精密度,准确度,检测限,定量限,选择性,线性与范围,耐用性,33,.,第三节 药品分析方法的验证,一、准确度（,accuracy,）,系指用该方法测定的结果与真实值或参考值,接近的程度,。,(,一,),含量测定方法,回收率,(,Recovery,),回收试验,加样回收试验,33,，至少,9,个测定结果,34,.,第三节 药品分析方法的验证,二、精密度,(,Precision),系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之,接近的程度,。,表示：,偏差,(,d,),、标准偏差,(,s,),、相对标准偏差,(,RSD,),重复性,:,同一实验室,同一人多次测定的精密度,中间精密度,:,同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度,重现性,:,不同实验室，不同人测定的精密度,35,.,第三节 药品分析方法的验证,三、专属性,(,S,pecificity,),指有其他成分（,杂质,、,降解物,、,辅料,等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。,目视法,信噪比法,S/N=3,四、检测限,(,Limit of Detection,LOD),药物能,被检出,的最低浓度,(g/ml),五、定量限,(,Limit of Quantitation,LOQ),药物能,被定量测定,的最低浓度,(g/ml),信噪比法,S/N=10,36,.,第三节 药品分析方法的验证,影响因素：,被测溶液的稳定性，流动相的组成和,pH,，商品柱的品牌，柱温等,六、线性与范围,(,L,inearity,A,nd,R,ange,),待测结果,(,响应值,),与试样中被测物的浓度或量直接成正比关系的程度。,Y=a+bx,（,r=0.9999),七、耐用性,(,Robustness),测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度,37,.,第三节 药品分析方法的验证,已有重现性验证，不需验证中间精密度,如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充,视具体情况予以验证,38,.,第三节 药品分析方法的验证,各种含量测定方法对效能指标的要求,1.,容量分析法,用原料药精制品,(,含量,99.5%,),或对照品考察方法的精密度，,RSD,0.2%,；回收率一般在,99.7,100.3%,之间,。,2.UV,法,用适当浓度的精制品进行测定，其,RSD,1%,。制剂的测定，回收率一般应在,98,102,之间,。,3.HPLC,法,要求,RSD2,，,回收率,98,102%,之间,。,39,.,第五章 生物制品分析方法的基本要求,一、常用样品的种类、采集和贮藏,(,一,),血样,血浆,(,plasma,),血清,(,serum,),全血,(,二,),唾液,(,三,),尿液,用于药物,剂量回收,、,尿清除率,、,生物利用度,，,药物代谢物,及其,代谢途径,、,类型,、,速率,等的研究；临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。,40,.,第四节 生物制品分析方法的基本要求,二、生物样品分析前处理技术,全血,/,血浆，组织,(1),蛋白沉淀,(2),调节,pH,选择性溶剂提取,RIA,残渣,化学衍生化,(,提取烃基化,),碱回提,酸回提,HPLC,UV,、,FLD,、,ECD,TLC,分光光度法,UV,、,FLD,GC,FID,ECD,N/P-FID,GC-MS,41,.,蛋白质的去除,加入与水混融的有机溶剂,(,乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃,),加入中性盐,(,饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐,),加入强酸,(,三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸,),加入金属沉淀剂,(,CuSO,4,-Na,2,WO,4,、,ZnSO,4,-NaOH,),缀合物的水解,酸水解,(,盐酸,),酶水解,(,葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素,),有机破坏,(,硝酸,-,高氯酸消化,),分离、纯化与浓集,液,-,液萃取法,(,Liquid-Liquid Extraction,LLE,),液,-,固萃取法,(,Liquid-Solid Extraction,LSE,),第四节 生物制品分析方法的基本要求,42,.,43,.,44,.,第四节 生物制品分析方法的基本要求,用有机溶剂,(,甲醇,),冲洗,洗净,用水冲洗,活化,上样,用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质,有机溶剂洗脱药物,收集洗脱液,45,46,.,第四节 生物制品分析方法的基本要求,三、定量分析方法的验证,药典附录,药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则,国家食品药品监督管理局新药评审中心,化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则,化学药物临床药代动力学研究技术指导原则,化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则,47,.,第四节 生物制品分析方法的基本要求,(,一,),、特异性,所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。,空白血浆,空白血浆标准物质,受试血浆,48,.,第四节 生物制品分析方法的基本要求,(,二,),、标准曲线与线性范围,6.4,12.8,19.225.6 32,3,2.4,1.8,1.2,0.6,0,茶碱,(g/ml),Y,=9.566,10,-2,X,+6.15310,-3,r,=0.9995,至少,6,个浓度点建立标准曲线,线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推,最低浓度点偏差在,20%,其余浓度点的偏差在,15%,。,49,.,(,三,),精密度与准确度,(,四,),定量下限,(,五,),稳定性,(,六,),提取回收率,(,七,),质控样品,(,八,),质量控制,(,九,),测定结果,第四节 生物制品分析方法的基本要求,50,.,Thank You!,51,.,