免疫组化结果判断及常见问题的分析.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组化结果判断及常见问题分析,武汉大学病理学教研室 杨飞,肝脏：,CK8,理想着色，胆管上皮细胞强阳性，,肝细胞呈不同层次阳性。,pan CK,（,AE1/AE3,）在肝脏理想的染色，采用了热修复。,肝细胞膜、胆管强而清晰的着色。背景干净。,一、特异性染色的判断,1.特定的定位,细胞阳性,根据靶抗原不同而呈现胞膜型、胞浆型,或胞核型,间质阳性,表现为细胞外着色，局限性或弥散性,2.染色的不均一性,阳性细胞的染色分布不均，片状或点状散在分布,染色强弱不等，颜色深浅反映抗原量的多少,3.,排除人为造成的非特异性染色,切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。,4.,颗粒性显色,DAB,显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。,免疫组化标准化照片,CK10,CD44v6,ER,合格,的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提,不合格,的免疫组化染色切片容易导致误判,C-erbB-2,优,良,中,差,4,3,2,1,ER,子宫内膜,PR,染色，修复不足 子宫内膜,PR,染色，修复良好,PR,编号,阳性片,待检片,阴性对照,结论,1,2,3,4,5,操作失误，抗体失效,非特异性着色,阳性片不含靶抗原,待检片不含定位抗原,待检片含定位抗原,二、染色结果的判断,PCNA,S-P,400,S-P,400,1-,day CM,4-,day CM,阳性强度,2010视野下，随机选取5个视野，测100个阳性细胞的平均光密度即为此片的阳性强度。,三、结果分析,P53,阳性细胞百分比,计数100个瘤细胞，其中阳性细胞的比例：,5%（）,5%30%（）,30%50%（）,50%（）,PCNA,Barnes,法,A：,瘤细胞显色有无及深浅,0（不着色）1（浅黄色）,2（棕黄色）3（棕褐色）,B：,显色细胞的比例,1（1%10%）,2（11%50%）,3（51%80%）,4（80%）,评分=,AB,0,分：阴性,14分：弱阳性,4分：强阳性,胶原染色,阳性面积百分比,4010视野，选取5个视野，计算阳性区域面积占整个参考面积的百分率。,CD34,Weidner,法（,MVD,计数）,孤立的棕黄色细胞族代表一条微血管。,低倍镜下找到组织内密度最高区域。,4010视野下计数微血管数目。,K-ras,VEGF,附：定量分析,图象处理系统,1、图象处理,：,利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变换、特征提取和测量。,1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正畸变。,2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征进行测量。,2、图象处理系统组成,图象输入（显微镜、扫描仪）,图象处理运算（病理图文分析软件）,图象、数据输出,3、图象处理系统功能,几何形态学定量分析,细胞核、浆的大小、面积、核浆比；细胞分布密度、个数；血管、腺体的面积、密度；间质的面积,免疫组织化学分析,按着色灰度分类，计算阳性、阴性细胞的面积含量,DNA,倍体分析,计算正常细胞及肿瘤细胞,DNA,含量，给出倍体参数、,DNA,参数分布直方图,AgNOR,分析,颗粒分析：数目、大小、面积、比例,四、免疫组化异常着色及对策,1.非特异性着色及其对策,非特异性着色原因,对策,操作过程冲洗不充分,每步冲洗,35min,内源性过氧化物酶,3,H,2,O,2,封闭,内源性生物素,使用生物素阻断试剂盒阻断,电荷吸附,非免疫动物血清封闭,抗体不纯,采用单克隆抗体,切片制片不当,改善取材和制片,加试剂后切片干燥,防止切片干燥,内源性生物素,肾小管,内源性生物素,淋巴结转移性甲状腺腺癌,蜕膜组织部分胞核,PR,阳性，血管内红细胞,过氧化物酶,显色,嗜酸性粒细胞中,细胞色素,显色,吞噬细胞内,含铁血黄素,坏死组织着色：,AE1/AE3,坏死组织着色,交叉反应：乳腺,ki-67,组织细胞胞浆着色,黑色素瘤，细胞内含,黑色素,，呈紫黑色，,HE,染色,灶状着色：机械原因着色,Cyclin D1,套细胞淋巴瘤,全片着色,全片着色,边缘着色,“阴阳脸”着色,气泡,非特异性着色原因,对策,操作过程冲洗不充分,每步冲洗,35min,内源性过氧化物酶,3,H,2,O,2,封闭,内源性生物素,使用生物素阻断试剂盒阻断,电荷吸附,非免疫动物血清封闭,抗体不纯,采用单克隆抗体,切片制片不当,改善取材和制片,加试剂后切片干燥,防止切片干燥,非特异性着色及其对策,无信号片,CD30,2.染色的假阴性及其对策,染色假阴性原因,对策,组织处理不当（固定、浸蜡）,改善条件，重取材,一抗与二抗种属连接错误,确定抗体种属无误,抗体失效,不得使用过期的试剂盒,显色系统不相适配,更换适配的显色系统,操作不当，遗漏重要步骤,严格遵守操作规程,无色或浅色片,MCL,理想的,CD5,着色。所有的瘤细胞都着色很强。散在的,T,细胞着色比瘤细胞深。,MCL,的,CD5,染色不足,(,一抗浓度太低,),。,MCL,瘤细胞几乎都没有着色。,3.,染色过弱原因及其对策,染色过弱原因,对策,抗体浓度过低，孵育时间过短,提高浓度，延长时间,滴加试剂时缓冲液未沥干,滴加试剂前沥干多余水分,过度蛋白封闭,缩短封闭时间,抗原被破坏,新鲜组织及时固定，固定时间不要超过,24,小时,室温太低，,15,适当延长孵育时间,