寡核苷酸介导的定点诱变.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,寡核苷酸介导的定点诱变,盒式诱变（,Cassette Mutagenesis,）,利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列，从而达到定点突变的目的，称为盒式诱变。实施盒式诱变时，,要求靶,DNA,插入点两侧有合适的限制酶单一切点,（图,45,）。,盒式诱变的例子,引物诱变（,Primer Mutagenesis,）,利用一段,含有突变序列,的寡核苷酸片段作为引物，经,DNA,复制过程合成靶,DNA,片段，使其子代链发生突变，称为引物诱变。,引物诱变的基本操作步骤：获得单链目的基因；人工合成带突变序列的引物；制备异源双链,DNA,；转染宿主细胞；筛选重组体；突变基因的鉴定和回收,Kunkel,诱变法,（,The Kunkel Mutagenesis Method,）,这是,1985,年由,Kunkel,等人建立的一种寡核苷酸引物诱变法，该法的操作步骤如下：将复制型的,M13,噬菌体转染到脱氧尿苷三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的,E.coli,（,dut-,，,ung-,）菌株中生长，使,U,取代,T,掺入到,DNA,链中（一般每个重组体,2030,个）；以此种带,U,的,DNA,链为模板，用带突变碱基的寡核苷酸引物进行复制，产生异源双链；将此异源双链转化到,ung菌株中生长，含,U,的模板链被破坏，从而使子代,DNA,链大部分（,80%,）含突变碱基序列,在dut,+,的,E.coli,中,dUTP酶,dUTP dUMP,在dUTP 酶缺失体中（dut,-,）,dUTP dUMP,dut：dUTPase突变，可导致,E.coli,dUTP,的量增加，当DNA复制时，可在很多应,该加dTTP的位置加入dUTP。,在正常情况下，尿嘧啶,-,-,糖基化酶,(ung,+,),可以去除掺入,DNA,中的尿嘧啶残基。但在,ung,-,的菌株中，此酶失活。,在大肠杆菌,dut,-,ung,-,菌株中生长的,M13,噬菌体的单链基因组,DNA,中将含有,20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染,ung+,菌株，尿嘧啶被迅速去除，,DNA,链遭到破坏，感染力下降约,5,个数量级。,此法的成功关键，是要得到好的含单链模板,DNA,。,这种方法得到的突变率太低，约为,1-5%,。主要原因是含突变位点的双链,DNA,，转入,E.coli,后，被其修复系统修复了。,快速引物诱变,（,QuikChange Primer Mutagenesis,）,这是由,Stratagene,公司开发的一种引物定点诱变法，该法的操作步骤如下：将带目的基因的重组体在,dam+,菌株中扩增，使,DNA,序列被,dam,甲基化酶所修饰；使用带突变碱基的寡核苷酸引物，在较高温度下复制子代链，形成双链突变体；用限制酶,Dpn,将带甲基化标记的亲代双链水解；将突变体转化宿主细胞,限制酶位点消除引物诱变,（,Primer Mutagenesis with Restriction Enzyme Site Elimination,）,限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的,DNA,片段的特性，去除不含突变碱基的亲代模板链，以提高定点突变效率的技术方法。,限制酶位点消除法的操作步骤是：将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链模板退火后，加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复制，产生具有硫代磷酸核苷酸的异源双链,DNA,；用特定的限制酶在此异源双链,DNA,上作切口，此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被切开，而新合成的子代链则无法切割；使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去除，然后再以含硫代磷酸核苷酸的子代单链为模板，经二次复制合成双链,