结直肠癌细胞源性外泌体中miR-17-5p的表达对结直肠癌细胞化疗敏感性的影响及其机制.pdf

第 49 卷 第 4 期2023年 7 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.4Jul.2023DOI：10.13481/j.1671587X.20230419结直肠癌细胞源性外泌体中 miR-17-5p的表达对结直肠癌细胞化疗敏感性的影响及其机制刘珊1,邢兆东2,黄平1（1.海南省人民医院肛肠外科，海南 海口 570100；2.中国医学科学院肿瘤医院胰胃外科，北京 100029）摘要 目的目的：分析结直肠癌细胞源性外泌体（Exo）中微小 RNA-17-5p（miR-17-5p）表达对结直肠癌细胞化疗敏感性的影响，阐明其可能的作用机制。方法方法：实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测人结直肠癌 HCT116细胞、CT26细胞、LoVo细胞、HT29细胞、SW620细胞、SW480细胞和人正常结肠直肠黏膜上皮 HIEC 细胞中 miR-17-5p 表达水平。CT26 细胞分为对照组、miR-NC inhibitor组和 miR-17-5p inhibitor组，提取各组细胞 Exo，透射电子显微镜观察 Exo形态表现，纳米粒子跟踪分析法检测粒径分布情况，Western blotting法检测 Exo中标志蛋白 CD9、CD63、凋亡诱导因子 6互作蛋白（Alix）和肿瘤易感基因 101（TSG101）蛋白表达水平，RT-qPCR 法检测 Exo中 miR-17-5p表达水平。CT26细胞分为对照组、Exo组、Exo-miR-NC inhibitor组和 Exo-miR-17-5p inhibitor组，分别以不同转染组 CT26细胞源性 Exo处理 CT26细胞，Exo绿色荧光标记 PKH67染料示踪法观察各组 CT26细胞摄取 Exo 情况，MTT 法检测 1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 和 40.00 mgL 1 5-氟 尿 嘧 啶（5-Fu）处理后各组 CT26细胞增殖抑制率，流式细胞术检测各组 CT26细胞凋亡率，细胞免疫荧光染色检测各组 CT26细胞中微管相关蛋白轻链 3B（LC3B）荧光强度，Western blotting法检测各组 CT26细胞中微管相关蛋白轻链 3 （LC3-）、微管相关蛋白轻链 3（LC3-）、自噬效应蛋白 Beclin-1和 P62 蛋白表达水平，并计算 LC3-/LC3-比值。结果结果：人结直肠癌 HCT116、CT26、LoVo、HT29、SW620 和 SW480 细胞中 miR-17-5p 表达水平明显高于 HIEC 细胞（P0.05）；分离到的颗粒物呈典型球形囊泡，粒径峰值约 140 nm，且 CD9、CD63、Alix 和 TSG101 蛋白均明显表达，表明成功分离到 Exo。与对照组比较，miR-17-5p inhibitor 组 Exo 中 miR-17-5p 表 达 水 平 明 显 降低（P0.05）。与对照组比较，Exo 组、Exo-miR-NC inhibitor组和 Exo-miR-17-5p inhibitor组 CT26 细胞周围均可见明显的 PKH67 染色，显示 CT26 细胞可摄取 Exo。与对照组比较，经 1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 和 40.00 mg L15-Fu 处理后 Exo 组 CT26 细胞增殖抑制率明显降低（P0.05），各组CT26细胞凋亡率明显降低（P0.05），细胞中LC3B荧光强度明显增强（P0.05），LC3-/LC3-比值和 Beclin-1蛋白表达水平明显升高（P0.05），P62 蛋白表达水平明显降低（P0.05）；与 Exo组比较，经 1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 和 40.00 mg L1 5-Fu 处 理 后 Exo-miR-17-5p inhibitor 组CT26细胞增殖抑制率和细胞凋亡率明显升高（P0.05），细胞中 LC3B 荧光强度减弱（P0.05），LC3-/LC3-比值和 Beclin-1蛋白表达水平明显降低（P0.05），P62蛋白表达水平明显升高（P0.05）。结论结论：抑制结直肠癌细胞源性 Exo中 miR-17-5p的表达可提高结直肠癌细胞的化疗敏感性，其作用机制可能与抑制细胞自噬水平有关。关键词 结直肠肿瘤；外泌体；微小 RNA-17-5p；化疗敏感性；细胞自噬中图分类号 R735.34文献标志码 A文章编号 1671587X(2023)04097510收稿日期 20220822基金项目 海南省卫健委 2021年度省卫生健康行业科研项目（21A200467）作者简介 刘 珊（1985），女，山东省菏泽市人，主治医师，医学硕士，主要从事普通外科基础和临床方面的研究。通信作者 黄 平，主任医师（E-mail：）975第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）Effect of expression of miR-17-5p in exosomes derived from colorectal cancer cells on chemosensitivity of colorectal cancer cells and its mechanismLIU Shan1,XING Zhaodong2,HUANG Ping1（1.Department of Anorectal Surgery，Hainan Provincial People s Hospital，Haikou 570100，China；2.Department of Pancreatic and Gastric Surgery，Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100029，China）ABSTRACT Objective：To analyze the effect of expression of microRNA-17-5p（miR-17-5p）in the colorectal cancer cell-derived exosomes（Exo）on the chemotherapy sensitivity of colorectal cancer cells，and to clarify its possible mechanism.Methods：Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）method was used to detect the expression levels of miR-17-5p in the human colorectal cancer HCT116 cells，CT26 cells，LoVo cells，HT29 cells，SW620 cells，SW480 cells，and human normal colorectal mucosal epithelial HIEC cells.The CT26 cells were divided into control group，miR-NC inhibitor group，and miR-17-5p inhibitor group，and the exosomes were extracted；the morphology of the Exo was observed under transmission electron microscope；the distribution of particle size was detected by nanoparticle tracking analysis；the expressions levels of marker proteins CD9，CD63，apoptosis-inducing factor 6 interacting protein（Alix），and tumor susceptibility gene 101（TSG101）in the Exo were detected by Western blotting method；the expression level of miR-17-5p in the Exo was detected by RT-qPCR method.The CT26 cells were divided into control group，Exo group，Exo-miR-NC inhibitor group，and Exo-miR-17-5p inhibitor group.The CT26 cells were treated with CT26 cell-derived Exo in different transfection groups，and the uptake of Exo by CT26 cells were observed by Exo green fluorescence marker PKH67 dye trace method；MTT assay was used to detect the inhibitiory rates of proliferation of the CT26 cells after treated with 1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，and 40.00 mg L1 5-fluorouracil（5-FU）；flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the CT26 cells in various groups；cell immunofluorescence staining was used to observe the expression intensities of microtubule-associated protein 1B light chain 3（LC3B）in the CT26 cells in various groups；Western blotting method was used to detect the expression levels of autophagy-related proteins microtubule-associated protein light chain 3 （LC3-），microtubule-associated protein light chain 3（LC3-），autophagy effector protein Beclin-1，and P62 proteins in CT26 cells in various groups，and the ratio of LC3-/LC3-was calculated.Results：The expression levels of miR-17-5p in the human colorectal cancer HCT116，CT26，LoVo，HT29，SW620，and SW480 cells were significantly higher than that in the HIEC cells（P0.05）；the isolated particles showed typical spherical vesicles with a peak particle size at about 140 nm，and the CD9，CD63，Alix and TSG101 proteins were all significantly expressed，indicating that Exo was successfully isolated.Compared with control group，the expression level of miR-17-5p in the Exo in miR-17-5p inhibitor group was significantly decreased（P0.05）；compared with control group，obvious PKH67 staining could be observed around the CT26 cells in Exo group，Exo-miR-NC inhibitor group，and Exo-miR-17-5p inhibitor group，indicating that the CT26 cells could take in the Exo.Compared with control group，the inhibitory rate of proliferation and the apoptotic rate of the CT26 cells in Exo group were decreased after treated with 1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，and 40.00 mgL 1 5-FU（P0.05），the intracellular LC3B fluorescence intensity was increased（P0.05），the ratio of LC3-/LC3-and the expression level of Beclin-1 protein were increased（P0.05），while the expression level of P62 protein 976刘珊，等.结直肠癌细胞源性外泌体中 miR175p的表达对结直肠癌细胞化疗敏感性的影响及其机制was decreased（P0.05）；compared with Exo group，the inhibitory rate of proliferation and apoptotic rate of the CT26 cells in Exo-miR-17-5p inhibitor group were increased after treated with 1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，and 40.00 mg L1 5-FU（P0.05），the intracellular LC3B fluorescence intensity was decreased（P0.05），the ratio of LC3-/LC3-and the expression level of Beclin-1 protein were decreased（P0.05），and the expression level of P62 protein was increased（P0.05）.Conclusion：The inhibition of expression of miR-17-5p in Exo derived from colorectal cancer cells can improve the chemosensitivity of the colorectal cancer cells，and the mechanism may be related to the inhibition of cell autophagy levels.KEYWORDS Colorectal neoplasm；Exosomes；MicroRNA-17-5p；Chemosensitivity；Cell autophagy结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，包括直肠癌和结肠癌，其发病率和死亡率在全球居于癌症前列，且呈逐年上升趋势1。早期结直肠癌无明显症状，且缺乏特异性较强的新型诊断标志物，因此大部分患者在确诊时已处于晚期并发生转移2。近年来，尽管手术、化疗、靶向治疗和免疫治疗等方法不断改进，但结直肠癌仍是全球第四大致死性癌症 3，手术结合化疗能够明显延长患者的预期寿命，5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）是结直肠癌的一线化疗药物，但大多数患者在治疗期间会产生 耐 药 性4-5，限 制 其 治 疗 效 果。因此，基于5-Fu 化疗法中的耐药性产生已成为提高结直肠癌临床治疗效果的主要障碍。越来越多的研究6-7表明：肿瘤细胞来源的外泌体（exosomes，Exo）通过将信号肽、非编码RNA 或 DNA 转移至邻近细胞或组织中，在重塑肿瘤微环境和肿瘤转移中发挥关键作用。存在于 Exo中的微小 RNA（microRNAs，miRNAs）可以被邻近或远处的细胞摄取，随后参与调节受体细胞。miRNAs 作为长度为 1724 nt 的小非编码 RNA，通过与 3-非翻译区结合来调节靶 mRNA 表达，从而调控各种癌症的进展8。miR-17-5p 在多种人类癌症中高表达且发挥促癌作用，在结直肠癌组织中也发现 miR-17-5p 表达水平明显高于相邻正常组织，并且通过调控相关分子机制促进结直肠癌进程9。研究10显示：肿瘤细胞来源 Exo中 miRNA 的表达水平与肿瘤化疗效果有密切关联，其在肿瘤细胞耐药性产生中发挥关键作用。本研究通过检测几种结直肠癌细胞系中 miR-17-5p 表达水平，探讨肿瘤细胞来源 Exo 中 miR-17-5p 表达在结直肠癌细胞对 5-Fu 化疗敏感性中的潜在作用，进一步阐明其可能的分子机制，以期为提高结直肠癌的化疗敏感性提供新靶点。1 材料与方法 1.1 细 胞细 胞、主 要 试 剂 和 仪 器主 要 试 剂 和 仪 器 人 结 直 肠 癌HCT116、CT26、LoVo、HT29、SW620 和SW480细胞及人正常结肠直肠黏膜上皮 HIEC 细胞（中国细胞系资源库），5-Fu（美国 TargetMol 公司），TRIzol 试剂盒（美国 Invitrogen 公司），Exo RNA 纯化试剂盒（上海欣言生物科技有限公司），一步法 miRNA 反转录试剂盒（北京信诺金达生物科技有限公司），miRNA 实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司），HiPerFect Trasfection Reagent 试剂盒（美国 QIAGEN 公司），Exo 提取试剂盒（上海贝博生物科技有限公司），Exo 绿色荧光标记 PKH67 染料、4，6-二脒基-2 苯基 吲 哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料和 MTT 增殖检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），Annexin-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（上海弗元生物科技有限公司），RIPA 缓冲液、BCA 蛋白测定试剂盒和 ECL 发光液（上海碧云天生物技术研究所），PVDF膜（美国 Corning公司），CD9、CD63、凋 亡 相 关 基 因 2 互 作 蛋 白 X（ALG-2 interacting protein X，Alix）、肿瘤易感基因 101（tumor susceptibility genes 101 TSG101）、微 管 相 关 蛋 白 轻 链 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）B、LC3-、LC3-、自噬效应蛋白 Beclin-1 和 P62 抗体（英国 Abcam 公司），GAPDH、辣根过氧化物酶标记二抗和 Alexa Fluor 488 标 记 荧 光 二 抗（北 京 博 奥 森 生 物 技 术有 限 公 司）。粒 径 分 析 仪（型 号：ZetaView PMX 110，德国 Particle Metrix 公司）1.2细胞转染和实验分组细胞转染和实验分组选用对数生长期 CT26细胞，调整密度为每孔 1105个细胞接种至 24 孔细胞培养板中，分为对照组、miR-NC inhibitor 组和 miR-17-5p inhibitor组，置于 37、5%CO2培养977第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）箱中培养。采用 HiPerFect Trasfection Reagent试剂盒 进 行 细 胞 转 染，分 别 将 miR-NC inhibitor 或miR-17-5p inhibitor 转染至对应分组细胞中，严格按照试剂盒说明书操作，对照组细胞不进行转染处理。转染结束后，继续培养 48 h，收集各组细胞提取 Exo。1.3 结 直 肠 癌结 直 肠 癌 CT26 细 胞细 胞 Exo 的 提 取 和 鉴 定的 提 取 和 鉴 定 CT26细胞转染后，在 37、5%CO2培养箱中培养 48 h，300 g 低温离心 15 min，留取上清液，2 000 g 低温离心 20 min，转移上清液至新离心管内，加入 Exo 提取试剂液，混合均匀，4 静置过夜。次日，将混合液 3 000 g 低温离心 30 min，弃去上清液留沉淀，重新溶解，10 000 g 低 温 离 心10 min，留沉淀，加入 PBS 缓 冲 液 重 悬 沉 淀，10 000 g 低温离心 10 min，加入 Exo保存液重悬沉淀，获得 Exo。透射电子显微镜观察 Exo 形态表现：取 50 L Exo 样品，滴于 200 目的铜网上，室温孵育 5 min，滤纸吸去铜网边缘多余液体，1%磷钨酸负染色 1 min，蒸馏水冲洗铜网后，吸去多余液体，白炽灯照射 8 min，待其充分干燥，采用透射电子显微镜观察铜网中颗粒形态表现。纳米粒子跟踪分析法检测 Exo粒径分布：采用 PBS缓冲液将Exo 样品浓度调整为 3107 mL1，采用粒径分析仪检测并分析 Exo粒径分布。Western blotting法检测 Exo 中 标 志 蛋 白 表 达 水 平：Exo 中 加 入 CD9、CD63、Alix和 TSG101一抗，以 CT26细胞为对照组，4 孵育过夜，加入对应二抗，室温孵育 1 h，TBST 洗 膜，ECL 显 影，凝 胶 系 统 成 像，观 察Exo 中上述 蛋 白 表 达 情 况。鉴 定 结 束 后，采用RT-qPCR法检测各组 Exo中 miR-17-5p表达水平。1.4 RT-qPCR 法 检 测 不 同 细 胞 和法 检 测 不 同 细 胞 和 Exo 中中miR-17-5p 表达水平表达水平采用 TRIzol试剂盒提取细胞总 RNA，采用 Exo RNA 纯化试剂盒提取 Exo 总RNA，收集提取的各组 RNA 样品，检测其质量和浓度。采用一步法 miRNA 反转录试剂盒进行逆转录，以获取 cDNA 为模板，通过 miRNA RT-qPCR仪检测 miR-17-5p 表达水平，以 U6 基因为内参。反 应 体 系 根 据 试 剂 盒 说 明 书 配 制，扩 增 条 件：95、3 min；95、12 s，62、40 s，95、15 s，循环 45 次。引物序列：miR-17-5p，上游引物 5-CGGCGGCAAAGTGCTTACAG-3，下游引物 5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3；U6，上 游 引物 5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3。下 游 引 物5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3，实验重复3 次，扩增结束后，采用 2Ct法计算不同细胞和各组 Exo中 miR-17-5p表达水平。1.5各组各组 Exo对对 CT26细胞干预处理细胞干预处理将 CT26细胞调整为每孔 1105个细胞密度接种至 96 孔细胞培养板中，实验分为 4 组：对照组，CT26 细胞正常 培 养；Exo 组，采 用 CT26 细 胞 来 源 Exo（10 mg L1）处 理 CT26 细 胞；Exo-miR-NC inhibitor 组，采用 miR-NC inhibitor 组 CT26 细胞来源 Exo（10 mg L1）处 理 CT26 细 胞；Exo-miR-17-5p inhibitor组，采用 miR-17-5p inhibitor组 CT26细胞来源 Exo（10 mg L1）处理 CT26 细胞。将以上 4 组细胞置于 37、5%CO2培 养 箱 中 培 养48 h，培养结束后收集各组细胞，进行后续实验。1.6PKH67 示踪法观察各组示踪法观察各组 CT26 细胞摄取细胞摄取 Exo情况情况将各处理组 CT26 细胞来源 Exo 重悬于 PBS缓冲液中，加入适量 PKH67染料，混匀，4 避光孵育 20 min，结束后 10 000 g 低温离心 30 min，弃上清，洗去多余染料，将沉淀重悬于 PBS 缓冲液中，备用。在 CT26细胞中添加 PKH67标记的各处理组 CT26细胞来源 Exo，在 37、5%CO2环境中孵育 12 h，PBS 缓冲液洗涤，DAPI 染核 10 min，洗 涤 后 封 片，干 燥，荧 光 共 聚 焦 显 微 镜 下 观 察PKH67 标记的 Exo 在 CT26 细胞周围的分布情况，并拍摄照片。1.7MTT 法检测法检测 5-Fu作用后各组作用后各组 CT26细胞增殖细胞增殖抑制率抑制率收集处理后的各组 CT26细胞，调整细胞密度为每孔 1105个，接种至 96孔细胞培养板中，分 别 添 加 含 0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 和 40.00 mg L1 5-Fu 的培养基，在 37、5%CO2环境中处理 48 h，每孔加入 20 L MTT 试剂液（5 g L1），37 继 续 孵 育 4 h 后，加 入150 L DMSO，通过摇床振荡，直至蓝紫色结晶甲瓒完全溶解，采用酶 标 仪 检 测 各 孔 细 胞 在490 nm 波长处的吸光度（A）值，并计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1实验组 A 值/对照组 A值）100%。1.8流式细胞术检测各组流式细胞术检测各组 CT26 细胞凋亡率细胞凋亡率收集处理后的各组 CT26 细胞，采用 10 mg L1 5-Fu处理 48 h，常规消化后离心，PBS缓冲液清洗，加入适量 1binding buffer 重悬细胞，调整细胞密度为 1106 mL1，吸取 100 L悬液移入流式检测管，依次加入 5 L Annexin-FITC 和 10 L 碘化丙978刘珊，等.结直肠癌细胞源性外泌体中 miR175p的表达对结直肠癌细胞化疗敏感性的影响及其机制啶，震荡混匀，室温孵育 10 min，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。1.9细胞免疫荧光染色法检测各组细胞免疫荧光染色法检测各组 CT26 细胞中细胞中LC3B 荧光强度荧光强度收集处理后的各组 CT26 细胞，采用 10 mg L1 5-Fu 处理 48 h，将 CT26 细胞接种于玻片表面进行爬片，PBS 缓冲液洗涤，4%多聚甲 醛 固 定，浸 入 0.1%Triton X-100 通 透 20 min，蛋白酶处理暴露抗原，山羊血清进行封闭处理，室温 封 闭 30 min。滴 加 兔 抗 LC3B 多 克 隆 抗 体（1 100），湿 盒 内 4 孵 育 过 夜。次 日，加 入Alexa Fluor 488 标记荧光二抗（1500），湿盒内37 孵育 1 h，DAPI染核 10 min，洗涤后封片，干燥，采用荧光显微镜观察细胞染色情况并拍摄照片，随机选择 6 个视野，采用 Image J 软件分析各组细胞 LC3B 相对荧光强度。荧光强度阳性荧光面积/总面积。1.10Western blotting 法检测法检测 Exo 和各组细胞中和各组细胞中凋亡相关蛋白表达水平凋亡相关蛋白表达水平在 Exo 中或各组 CT26 细胞中加入 RIPA 缓冲液裂解，提取上清液，BCA 法测定蛋白浓度。配置浓缩胶与分离胶，将蛋白与上样缓冲液混合后煮沸 10 min变性，在样孔加入等量蛋白样品上样，电泳分离蛋白，电转印法移至PVDF膜上。经 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，滴加稀释的一抗，4 孵育过夜，TBST 洗膜，再滴加稀释 的 对 应 二 抗，室 温 孵 育 1 h，TBST 再 洗 膜，ECL 显影曝光，EPSON 仪扫描胶片并拍摄蛋白图像，以 GAPDH 为内参蛋白，采用 Image J 软件分析各目的蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。1.11统计学分析统计学分析采用 SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，采用 GraphPad Prism 8.0软件绘制统计图。Exo 和 各 组 细 胞 中 miR-17-5p 表达水平，Exo处理各组 CT26细胞增殖抑制率和细胞凋亡率，各组 CT26 细胞中 LC3B、Beclin-1 和 P62 蛋白表达水平及 LC3-/LC3-比值，均符合正态分布，以xs表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两 比 较 采 用 LSD-t 检 验。以P0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.1不同人结直肠癌细胞中不同人结直肠癌细胞中 miR-17-5p 表达水平表达水平 与 人 正 常 结 肠 直 肠 黏 膜 上 皮 HIEC 细 胞（1.000.04）比 较，人 结 直 肠 癌 HCT116、CT26、LoVo、HT29、SW480 和 SW620 细 胞 中miR-17-5p 表 达 水 平（1.830.07、3.010.03、2.530.02、2.340.05、2.050.03 和 2.140.06）明显升高（P0.05），其中 CT26 细胞中miR-17-5p 表 达 水 平 最 高，故 以 下 实 验 均 采 用CT26细胞。2.2Exo 鉴定鉴定在透射电子显微镜下观察到提取的颗粒物呈典型的球形囊泡（图 1A）；粒径峰值约在 140 nm 处（图 2B）；Western blotting法检测结果显示：Exo标志蛋白 CD9、CD63、Alix和 TSG101均明显表达（图 1C），表明该颗粒物为 Exo。A：Morphology of Exo observed under TEM（Bar=50 nm）；B：Diameter and particle size distribution detected by TNA；C：Electrophoregram of expressions of CD9，CD63，Alix，and TSG101 proteins in Exo detected by Western blotting method（Lane 1：CT26 cell group；Lane 2：Exo group）.图图 1Exo的表征鉴定的表征鉴定Fig.1Identifications of characterization of Exo979第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）2.3各组各组 Exo 中中 miR-17-5p 表达水平表达水平CT26 细胞经转染后提取各组细胞 Exo，RT-qPCR 法检测结果显示：与对照组（1.000.03）和 Exo-miR-NC inhibitor 组（1.000.03）比 较，Exo-miR-17-5p inhibitor 组 Exo 中 miR-17-5p 表 达 水 平（0.360.03）明显降低（P0.05）。2.4CT26 细胞摄取细胞摄取 Exo 情况情况经 PKH67 荧光标记的 Exo 处理 CT26 细胞后，采用荧光显微镜观察，对 照 组 CT26 细 胞 周 围 未 见 PKH67 荧光，Exo 组、Exo-miR-NC inhibitor 组和 Exo-miR-17-5p inhibitor 组 CT26 细 胞 周 围 均 可 见 PKH67 荧 光。见图 2。2.5各组各组 CT26细胞增殖抑制率细胞增殖抑制率经 1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和 40.00 mg L1 5-Fu处理后，与对照组比较，Exo 组 CT26 细胞增殖抑制率明显降低（P0.05）；与 Exo 组比较，Exo-miR-17-5p inhibitor 组 CT26 细胞增殖抑制率明显升高（P0.05）。见图 3。2.6各组各组CT26细胞凋亡率细胞凋亡率与对照组（46.80%0.09%）比较，Exo 组 CT26 细胞凋亡率（7.010.03%）明 显 降 低（P0.05）；与 Exo 组 比 较，Exo-miR-17-5p inhibitor 组细胞凋亡率（56.60%0.15%）明 显 升 高（P0.05）。见图 4。2.7各组各组 CT26细胞细胞 LC3B荧光强度荧光强度细胞免疫荧图图 2PKH67示踪法观察各组示踪法观察各组 CT26细胞摄取细胞摄取 Exo情况情况（200）Fig.2Uptake of Exo by CT26 cells observed by PKH67 trace method（200）*P0.05 vs control group；P0.05 vs Exo group.图图 3MTT法检测各组法检测各组 CT26细胞增殖抑制率细胞增殖抑制率Fig.3Inhibitory rates of proliferation of CT26 cells in various groups detected by MTT method980刘珊，等.结直肠癌细胞源性外泌体中 miR175p的表达对结直肠癌细胞化疗敏感性的影响及其机制光染色检测结果显示：与对照组（0.110.03）比较，Exo 组细胞中 LC3B 荧光强度（0.620.08）明 显 升 高（P0.05）；与 Exo 组 比 较，Exo-miR-17-5p inhibitor 组 细 胞 中 LC3B 荧 光 强 度（0.160.07）明显降低（P0.05）。见图 5。2.8 各 组各 组 CT26 细 胞 中细 胞 中 LC3-/LC3-比 值 和比 值 和Beclin-1 及及 P62 蛋白表达水平蛋白表达水平Western blotting 法检测结果显示：与对照组比较，Exo 组 CT26 细胞中 LC3-/LC3-比值和 Beclin-1 蛋白表达水平明显升高（P0.05），P62 蛋白表达水平明显降低（P0.05）；与 Exo 组 比 较，Exo-miR-17-5p A：Control group；B：Exo group；C：Exo-miR-NC inhibitor group；D：Exo-miR-17-5p inhibitor group.图图 4流式细胞术检测各组流式细胞术检测各组 CT26细胞凋亡率细胞凋亡率Fig.4Apoptotic rates of CT26 cells in various groups detected by flow cytometry图图 5免疫荧光染色法检测各组免疫荧光染色法检测各组 CT26细胞中细胞中 LC3B表达情况表达情况（200）Fig.5Expressions of LC3B in CT26 cells in various groups detected by immunofluorescence staining（200）981第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）inhibitor 组 CT26 细 胞 中 LC3-/LC3-比 值 和Beclin-1 蛋白表达水平明显降低（P0.05），P62蛋白表达水平明显升高（P0.05）。见图 6。3 讨 论 化疗是结直肠癌手术前后重要的辅助治疗手段，5-Fu 作为肿瘤化疗中最常使用的药物之一，其单独使用或与其他药物联用是晚期结直肠癌患者应用最多