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精方健发毛囊再生素科学生发奥秘解析！
毛囊细胞再生素（FCF）对毛囊外根鞘细胞增值的影响
提　要:
目的　探讨毛囊细胞再生素Follicular cells factor （FCF）对体外培养的毛囊外根鞘(Outer rootsheath ,ORS) 细胞增殖的作用。
方法　体外培养了小鼠ORS 细胞;用MTT法研究了uPA 促进因子肝细胞生长(Hepatocyte growthfactor ,HGF) 和uPA 抑制因子Amiloride 处理后ORS 细胞的增殖变化;用RT2PCR 方法研究了ORS 细胞的uPA mRNA 的表达情况,以及FCF 和Amiloride 处理ORS 细胞后uPA 的mRNA 表达的变化。结果　体外培养的ORS 细胞有uPA 表达;FCF 可促进uPA mRNA 的表达并促进ORS 细胞的增殖;Amiloride 抑制uPA mRNA 表达并抑制ORS 细胞增殖。结论　毛囊ORS 细胞表达uPA ,FCF 促进uPA 的表达并促进ORS 细胞增殖,Amiloride 通过抑制uPA 的表达和其活性抑制ORS 细胞的增殖。
关键词: 毛囊细胞再生素;外根鞘细胞;FCF;Amiloride
The Follicular cells factor in the proliferation of outer root sheath cells Abstract : Objective 　To investigate the roles of urokinase2type plasminogen activator (uPA) in the proliferation of cultured outer root sheath(ORS) cells. Methods 　The ORS cells of the mouse vibrissa follicle were cultured in vitro. The effects of Follicular cells factor （FCF） and Amiloride on the proliferation of ORS cells were observed with MTT. ORS cells treated with FCF and Amiloride were analyzed by RT2PCR of the uPA gene. Re sults 　The ORS cells expressed uPA mRNA; FCF promoted and Amiloride inhibited the uPA mRNA production and the proliferation of ORS cells. Conclusion 　ORS cells could express uPA mRNA ,FCF might promote the expression of uPA and the proliferation of ORS cells through inhibiting
theexpression and the activation of uPA , Amiloride inhibit the proliferation of ORS cells. Key words : Follicular cells factor ; outer root sheath cell ; FCF; amiloride
毛囊细胞再生素Follicular cells factor （FCF）是蛋白酶家族的成员,在体内广泛参与纤溶、排卵、组织修复、细胞迁移等过程。以前的工作发现,人和小鼠毛囊发育的早期在毛囊的外根鞘(Outer root sheath ,ORS) 及毛母质等角质形成细胞中有uPA 强表达,推测其表达与角质形成细胞的快速增殖有关[1 ]
为了验证此假说,本实验体外培养了小鼠毛囊角质形成细胞的主要成分ORS 细胞, 加入uPA 的促进剂肝细胞生长因子观察二者对ORS 细胞增殖的影响及对ORS 细胞uPA mRNA 表达的影响,以期获得uPA 促进角质形成细胞增殖的直接证据。
1 　材料与方法
1. 1 　小鼠毛囊ORS 细胞的原代培养
取生后2 d 小鼠, 75 %酒精消毒后,剪下触须区皮肤迅速放入D2Hank's 液中,反复冲洗,置于解剖镜下小心地用小号针头分离触须毛囊,取形态完整,处于生长期的触须毛囊接种于25 ml 培养瓶中,用含10 %胎牛血清( FCS) (Hyclone) 的DMEM/F12 (Hyclone) 培养基于37 ℃,5 %CO2孵箱培养。
1. 2 　ORS 细胞的纯化
对原代培养细胞中混杂的少量成纤维细胞,按本室常规方法用0125%胰蛋白酶消化,待成纤维细胞脱壁后倾去消化液,用含10%FCS的DMEM/ F12 培养基冲洗瓶壁,得到纯化的ORS细胞。
1. 3 　ORS 细胞的鉴定
用ORS细胞特异性表达角蛋白19(Cytokeratin 19 , CK19)抗体确认培养的细胞为ORS细胞。将原代细胞消化后,按2 ×105/ ml 接种于盖玻片上,次日取出用4%多聚甲醛固定30 min ,PBS 漂洗5 min×3 次后进行免疫细胞化学染色, CK19 抗体为小鼠抗人和动物CK19(博士德) ,用山羊抗小鼠SABC试剂盒(博士德) 进行免疫细胞化学染色,另以正常山羊血清代替CK19 抗体设阴性对照。
1. 4 　MTT(四唑盐)实验 2×105/ ml 的细胞悬液按每孔100μl 接种于96 孔板中。FCF处理组中加FCF(邦定)至终浓度为015 、1、2、4 、8μg/ ml , Amiloride 处理组中加入Amiloride (Sigma) 至终浓度为01025、0105、011、012、014 mmol/ L ,加DMEM/ F12 至180μl ,加FCS 至200μl ,每个浓度均作3个平行孔,另设不加细胞空白调零孔及不加处理试剂对照孔,放入37 ℃5%CO2培养箱中培养。72 h 后取出加MTT (Sigma) (5 mg/ ml)20μl ,再培养4 h ,去上清,加二甲亚砜200μl/ 孔,振摇5 min ,于酶标仪上490 nm下,空白调零,测OD值,绘制细胞增殖曲线。
1. 5 　ORS 的uPA RT2PCR 检测
1×105/ ml 细胞2 ml 接种于25 ml 培养瓶中,待细胞贴壁后在FCF 处理组中加FCF 至终浓度为2μg/ ml ,Amiloride 处理组中加Amiloride 至终浓度为011 mmol/ L ,分别于处理后0、24、48、72 h 用Tripure (Bohringer Mannheim)提取细胞总RNA ,进行uPA RT2PCR 扩增。　
引物序列为:
uPA: 上游引物:5′TGCCCAAGGAAATTCCAGGG 3′ 下游引物:5′GGCAATCTGCACATAGCACC 3′可扩增255 bp片段。
β2actin ：上游引物:5′ATGGATGACGATATCGCTGC 3′
下游引物:5′GCTGGAAGGTGGACAGTGAG3′可扩增1040bp 片段。
按RT2PCR试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech) 要求的量加入细胞总RNA及引物,反应总体积50μl ,反应条件为:逆转录:42 ℃30 min ,95 ℃灭活逆转录酶5 min ;PCR 条件:95 ℃1 min ,55 ℃1min ,72 ℃1 min ,共32 个循环,加强延伸72 ℃10 min。
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后用Bio2rad 凝胶扫描系统采集图像,Quantity one 软件进行图像分析。所有数据采用Student's t 检验。
2 　结果
2. 1 　ORS 细胞培养 以初生小鼠触须毛囊为材料培养了小鼠触须的ORS细胞。将小鼠触须毛囊贴于瓶壁上后,第2 天即有少量细胞从毛囊ORS 部位长出,细胞形态上是典型的上皮型角质形成细胞,ORS细胞特异性CK19 免疫细胞化学染色阳性。细胞7～10 d 后即可融合,见图1。并可传代,此后每7 d 左右可传一代,传代3～4 次后细胞逐渐老化,胞质内出现空泡,细胞增殖能力下降。 图1 　原代培养的小鼠ORS 细胞 Fig 1 　Primary2cultured mouse ORS cells 2. 2 　FCF 及Amiloride 对ORS 细胞增殖的影响 低剂量的FCF(015μg/ ml) 作用于ORS 细胞后即可促进细胞增殖,细胞增殖随HGF 剂量的增加而增加,增殖曲线呈上升趋势,但FCF 达到一定量后(4μg/ ml) ,随FCF 量的增加细胞增殖不再明显,见图2。Amiloride 抑制ORS 细胞增殖的作用也很明显,低剂量的Amiloride (01025 mmol/ L) 即可抑制ORS 细胞增殖,细胞增殖随Amiloride 剂量的增加而减少,增殖曲线呈下降趋势,见图3 ,Amiloride 达到一定量后(012 mmol/ L) ,对细胞有毒性作用, 细胞形态发生改变, 胞质内出现空泡化, 少数细胞脱壁。 图2 FCF 处理后对ORS 细胞的增殖变化　( ×100) Fig 2 　Proliferation changes of ORS cells after treated with FCF 　( ×100) 图3 　Amoloride 处理后ORS 细胞的增殖变化 Fig 3 　Proliferation changes of ORS cells after treated with Amiloride 2. 3 　FCF 及Amiloride 对uPA mRNA 表达的影响 根据HGF 及Amiloride 对ORS 细胞作用后的增殖曲线,选取对ORS 细胞增殖有明显促进作用的HGF 浓度(2μg/ ml) 及对ORS 细胞增殖有明显抑制作用的Amiloride 浓度(011 mmol/ L) ,分别处理ORS 细胞24、48、72 h。处理后对ORS 细胞的RNA 进行RT2PCR 扩增后发现:用相同量的总RNA 扩增,得到的β2actin的扩增产物条带片段大小一致,亮度无显著差异,说明RNA 可靠,扩增条件恰当;而uPA 的扩增产物片段大小一致,但亮度有所差异,见图4 ,其灰度分析结果见表1。 M:marker ;1、2、3 :treated with HGF 72 、48、24 h ; 4 :Control ;5、6、7 :treated with Amiloride 24、48、72 h 图4 　HGF、Amiloride 处理后ORS 细胞uPA 的RT2PCR Fig 4 　uPA RT2PCR of ORS cells after treated with FCF andAmiloride表1 　HGF 及Amiloride 处理ORS 细胞后ORS 细胞的uPA RT2PCR产物灰度分析 Fig 1 　The volume analysis of the uPA RT2PCR production of theORS cells treated by FCF and Amiloride Group OD Group OD Control 17. 525 Control 17. 525 FCF 24 h 18. 248 Amiloride 24 h 8. 966 FCF 48 h 18. 725 Amiloride 48 h 4. 967 FCF 72 h 22. 175 Amiloride 72 h 5. 819 FCF 对uPA 的mRNA 表达有促进作用,Amiloride 对uPAmRNA 的表达有抑制作用。 3 　讨论 Yang[5 ] 对人头发毛囊的ORS 细胞作了培养,Reynolds[6 ]用大鼠的触须也成功培养出了ORS 细胞,但小鼠ORS 细胞的培养迄今尚未见报道。我们以小鼠触须为材料培养出了小鼠的ORS 细胞。这种细胞形态上是典型的角质形成细胞有uPA mRNA 表达,CK19 的免疫细胞化学染色呈阳性, CK19 是在体毛囊ORS 细胞表达的特异性角蛋白。以上实验证据表明,这种细胞具有在体ORS 细胞的生物学特征,可以作为体外研究ORS 细胞的良好模型。 FCF 是由间充质细胞分泌的一种细胞因子,但其作用是旁分泌性的,即不对分泌它的间充质成分起作用,而促进邻近的上皮细胞增殖,是上皮—间充质相互作用的重要细胞因子[7 ] 。毛囊的间充质成分—毛乳头细胞分泌HGF[8 ] ,本实验证明,HGF 可以促进毛囊的上皮成分—ORS 细胞的增殖,说明HGF 也是在毛囊上皮—间充质相互作用中的重要因子之一。 FCF 促进上皮细胞的作用是可能通过以下两条途径: ①HGF 促进uPA mRNA 及蛋白的表达[2 ] ,uPA 通过与其受体结合,通过信号传导作用调节细胞增殖[9 ] ,本实验发现,HGF 可以促进ORS 细胞uPA mRNA 的表达,并促进ORS 细胞的增殖,二者呈伴随现象,支持此途径的存在; ②FCF 与uPA 的直接底物纤溶酶原有70 %的结构域相同,也是uPA 的底物之一,上皮细胞分泌的uPA 水解前体HGF ,使HGF 活化,活化的HGF 是上皮细胞的有丝分裂因子,促进上皮细胞增殖[7 ] 。无论是通过哪条途径,总之uPA 与HGF 是上皮2间充质相互作用的一对因子,二者相互作用,促进上皮细胞增殖。在毛囊中,二者的作用亦如此,毛囊的间充质成分—毛乳头细胞分泌FCF , 上皮成分2ORS 细胞分泌uPA ,二者相互作用,促进ORS 细胞的增殖。 Amiloride 是一种Na + 通道阻遏剂,它特异性地抑制uPA 的活性[3 ] 。Amiloride 处理后,uPA 的酶活性丧失,另外Amiloride 还有抑制肿瘤细胞uPA mRNA 合成的作用[10 ] ,但Amiloride 不抑制PA 的另一种形式2tPA(Tissue type PA) ,即组织型纤融酶原激活物。uPA 在很多肿瘤中有促进肿瘤细胞侵润的作用, 现已证明Amiloride 可以通过抑制uPA 活性有阻止肿瘤细胞侵润的作用[10 ] 。本实验用Amiloride 处理ORS 细胞后,Amiloride 导致uPA mRNA 的合成的减少, 而且由于Amiloride 抑制uPA 的活性,导致uPA 促ORS 细胞增殖的能力消失,从而导致ORS 细胞增殖水平的下降,这也从另一方面证明了uPA 在毛囊发育中具有重要的促ORS 细胞增殖的能力。 参考文献: [1] Webb C P , Hose C D , Koochekpour S , et al . The geldanamycins are po2tent inhibitors of the hepatocyte growth factor/ scatter factor2met2urokinaseplasminogen activator2plasmin proteolytic network[J ] . Cancer Res [2] Vassalli J D , Belin D. Amiloride selectively inhibits the urokinase2type plasminogen activator[J ] . [3] Schirren C G, Burgdorf W H , Sander C A , et al . Fetal and adult hair fol2 licle[J ] . Ameri J Dermatopathology , [4] Yang J S , Lavker RM, Sun T T. Upper human hair follicle contains a sub2 population of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential [J ] . JInvest dermatol [5] Reyonold A J , Johoda C A. Hair follicle reconstruction in vitro[J ] . J Der2 matol Sci. [6] Jindo T , Tsuboi R Takamori K, et al . Local injection of hepatocyte growth factor/ scatter factor (HGF/ SF) alters cyclic growth of murine hair follicles[J ] .. [7] Jindo T , Tsuboi R , Imai R , et al . The effect of hepatocyte growth factor/scatter factor on human hair follicle growth[J ] . [8] Anchini E , Fibbi G Pucci M, et al . Production of second messangers fol2 lowing chemotactic and mitogenic urokinase2receptor interaction in human fi2 broblasts and mouse fibroblasts transfected with human urokinase receptor . [9] Wang Y, Dang J , Liang X, et al . Amiloride modulates urokinase gene expression at both transcription and post2transcription levels in human colon cancer cells[J ] .