陆地棉PUP家族基因的鉴定及表达分析.pdf

山西农业科学 2023，51（9）：983-995Journal of Shanxi Agricultural Sciences陆地棉 PUP家族基因的鉴定及表达分析陈云，赵博雅，刘颖，王铭瑶，孟婷（湖北师范大学 生命科学学院，湖北 黄石 435002）摘要：为了有助于开展陆地棉 PUP家族基因的生物学功能研究，也为后续陆地棉 PUP基因在抗逆中功能的研究提供候选基因，利用生物信息学从陆地棉中鉴定 PUP基因，并对 PUP基因结构、保守结构域、顺式作用元件以及在胁迫条件下的表达等进行分析。结果表明，从陆地棉（TM-1）中共鉴定出 31个 PUP 基因，依据进化分析结果，将这些基因分为 3个亚支。染色体定位及基因复制事件分析结果表明，31个 GhPUP家族基因分布在 19条染色体上，且所有的 PUP 基因都由基因复制事件产生，复制类型为片段重复；基因结构的分析结果显示，陆地棉PUP基因大多数只有 1个内含子，少数有 2个或 3个内含子，也有少数基因没有内含子；保守结构域分析表明，不同亚支上的 PUP蛋白既有共同性也有特异性。顺式作用元件分析结果显示，GhPUPs基因启动子区域共有 18个元件，这些元件分属于激素应答、胁迫/物理应答以及植物生长发育相关元件 3类。同时，结合进化分析和转录组数据，筛选出了参与陆地棉胁迫应答的 PUP基因。关键词：陆地棉；PUP家族基因；细胞分裂素；胁迫应答中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：10022481（2023）09098313Identification and Expression Analysis of PUP Family Gene in Gossypium hirsutumCHEN Yun，ZHAO Boya，LIU Ying，WANG Mingyao，MENG Ting（School of Life Science，Hubei Normal University，Huangshi 435002，China）Abstract：In order to facilitate studies on biological function of PUP family genes in Gossypium hirsutum,and provide candidate genes for subsequent studies on the function of PUP genes in stress resistance,in this study,31 PUP genes were identified in Gossypium hirsutum(TM-1)genome using bioinformatics,and could be classified into 3 subfamilies according to polygenetic analysis.The results of chromosome location and gene replication analysis showed that 31 GhPUP genes were distributed on 19 chromosomes,and all PUP genes were generated by gene replication events,and the duplication type was fragment duplication.Gene structure analysis indicated that most PUP genes had only one intron,a few had two or three introns,and a few had no introns.Conserved domain analysis showed that both commonality and specificity existed between PUP proteins in different subfamilies.Cis-acting elements analysis showed that there were 18 elements in the GhPUP genes promoter region,which were classified into three categories:hormone response,stress/physical response,and plant growth and development related elements.At the same time,combined with evolutionary analysis and transcriptome data,PUP genes involved in stress response in Gossypium hirsutum were screened.Key words：Gossypium hirsutum;PUP family gene;cytokinins;stress response细胞分裂素（Cytokinin，CK）是一种重要的植物激素，它在植物的生长和发育过程中有着至关重要的作用，能够促进细胞的分裂与分化1-2，控制芽的平衡和营养的转导信号，提高作物产量3，形成顶端优势4-5，延迟衰老6-7以及对生物和非生物胁迫的响应8-10等。近年来，关于 CK 的合成与代谢途径以及信号转导途径的研究取得了突破性的进展11。植物中天然存在的 CK 是腺嘌呤的衍生物，在腺嘌呤环上的第 6 位氮原子（N6）上通过共价键连接不同的侧链形成腺嘌呤的衍生物11-13，根据侧链的类型，CK 可以分为异戊烯基型 CK 和芳香型 CK，它们可以在植物体内的不同位置合成，然后经过木质部或者韧皮部从茎运输到根。异戊烯基型 CK主要包括异戊烯基腺嘌呤（Isopentenyl adenine，iP）、顺doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.03收稿日期：2023-06-12基金项目：国家自然科学基金项目（32001594）；湖北省自然科学基金创新发展联合基金项目（2022CFD048）；食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室开放基金项目（EWPL201712，EWPL201803）；湖北师范大学教学改革研究项目（2021057，2021059）；湖北师范大学课程思政教学改革研究项目（KCSZY202108，KCSZY202127）作者简介：陈云（1987-），女，湖北钟祥人，讲师，博士，主要从事植物分子遗传学研究工作。陈云、赵博雅为同等贡献作者。983山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期式玉米素(cis-zeatin，cZ)、反式玉米素(trans-zeatin，tZ)和二氢玉米素(Dihydrozeatin，DZ)14。其中，异戊烯基腺嘌呤和反式玉米素是植物中存在最广泛的2 种 CK，比如拟南芥中既有异戊烯基腺嘌呤又有反式玉米素，而水稻和玉米中主要含有顺式玉米素。芳香型的 CK 仅在较少的植物中发现，比如拟南芥、白杨。在 CK 合成过程中有一个非常重要的基因，就是 异 戊 烯 基 转 移 酶 基 因（Isopentenyl transferase gene，ipt），其编码的异戊烯基转移酶是催化细胞分裂素合成的关键酶15，也是限速酶，但是该基因的表达具有组织和细胞特异性，因此，合成的 CK需要通过特定的方式运输到其他的组织或细胞中使用。在此过程中，一些起 CK 运输作用的蛋白就非常重要。细胞分裂素通过木质部从根输送到芽(主要以tZ 型细胞分裂素形式)，通过韧皮部从芽输送到根(主要以 iP 型细胞分裂素形式)11，16-17。目前的研究认为，核苷型 CK 是植物体内 CK 的主要转运形式，其转运蛋白分为浓缩型核苷转运蛋白(Concentrative nucleoside transporters，CNTs)和平衡型核苷转运蛋白（Equilibrative nucleoside transporters，ENTs）18。目前，关于植物中的 CNT 型转运蛋白的研究报道较少，而 ENT 型转运蛋白的研究报道较多。比如，拟南芥 AtENT3 和 AtENT8 已被证实具有转运核苷型 CK 的能力19，OsENT2 在水稻中也有潜在的转运核苷型 CK 的能力20。除了上述 2 种类型的转运蛋白之外，在拟南芥中，还发现了另一种称为嘌呤渗透酶（Purine permeases，PUPs）的转运蛋白，同样在 CK 的运输过程中发挥着重要的作用21，因为PUP 蛋白对嘌呤具有很高的亲和性，所以，在植物体中主要介导嘌呤或嘌呤类似物的运输。而在早期 GILLISSEN 等22对拟南芥 PUP 家族基因的研究中发现，AtPUP1 和 AtPUP2 是一类高亲和质子耦合蛋白，可以通过高亲和质子耦合转运系统透过细胞膜，AtPUP1 的主要作用是回收拟南芥叶片中的 CK，AtPUP2 的主要作用是介导维管及薄壁组织间 CK 的运输，这些研究成果对 PUP家族基因的功能及作用也提供了强有力的证据。此外，对水稻中 OsPUP7基因的研究发现，该基因主要在未成熟的种子、胚乳以及幼穗中表达，其编码的蛋白具有转运 CK的能力23。棉花是最重要的纤维作物，也是重要的油料作物之一。因此，棉花在世界范围内被广泛种植。此外，棉花原产于热带和亚热带地区，并表现出一定程度的抗压力24。然而，棉花经常受到各种非生物胁迫（如干旱、高温等），在其生长周期内，多种非生物胁迫会导致棉花产量下降或棉纤维质量变差。尤其当干旱胁迫超出棉花植物在生殖生长阶段的自我保护能力时，不可避免地导致纤维产量和质量严重下降25。因此，提高棉花植株的抗旱性对世界农业非常重要。PUP 家族基因具有运输 CK 的功能，CK 在植物的生长发育、形态建成和逆境应答等方面具有重要作用。然而到目前为止，在陆地棉中尚未有 PUP 转运基因的相关报道，对于陆地棉中PUP 家族基因的数量和功能也未知。因此，利用生物信息学方法鉴定陆地棉中 PUP 基因对研究该家族在参与棉花抗逆中的功能角色具有重要的理论意义。本研究利用生物信息学从陆地棉中鉴定 PUP基因，并对 PUP 基因的结构、保守结构域、顺式作用元件进行分析，同时了解 PUP 家族基因在胁迫条件下的表达模式，旨在为陆地棉抗旱研究提供候选基因。1 材料和方法1.1基因序列的数据来源拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtPUP 家族基因的基因组序列从TAIR（https:/www.arabidopsis.org/）数据库中获取；水稻（Oryza sativa）OsPUP家 族 基 因 的 基 因 组 序 列 从 RGAP（http:/rice.plantbiology.msu.edu/）数据库中获取14；陆地棉的全基因组序列来自于GRAND（https:/）数 据 库，使 用 版 本 为“G.hirsutum_TM-1_HAU”。1.2陆地棉PUP家族基因的鉴定利用已研究报道的拟南芥和水稻的 PUP 蛋白的氨基酸序列，通过 BLAST 陆地棉的全基因组数据库，搜索基因组中的同源序列，从而获得陆地棉的PUP基因候选序列，阈值为1e-10，取2次BLAST结 果 的 交 集。使 用 SMART 工 具（http:/smart.embl-heidelberg.de/）对候选陆地棉 PUP 蛋白序列进行验证，获得最终 31 个陆地棉 PUP 基因。通过在线网址 ExPASy（https:/www.expasy.org/），利用网址中的 ProtParam 工具，对陆地棉 PUP 蛋白的大小、分子质量、理论等电点及亲水性等理化性质进行分析。1.3陆地棉PUP基因系统进化树的构建首先，通过 MEGA 11软件23对拟南芥、水稻和984陈云等：陆地棉 PUP家族基因的鉴定及表达分析陆地棉的 PUP 蛋白进行多序列比对，然后运用相邻链接法（Neighbor-Joining，NJ），模型选择改序列组 的 最 优 模 型 JTT，校 验 参 数 Bootstrap 设 置 为1000，构建系统发育进化树，从而对拟南芥、水稻、陆地棉 PUP 家族基因的进化关系进行分析，并进行亚族的分类。1.4陆地棉PUP基因的染色体定位与共线性分析为了确定陆地棉 PUP基因在染色体上的位置，可以通过植物全基因组数据库 GRAND（https:/）中 gff3 文件中筛选出 PUP 基因位置信息，然后使用 TBtools软件26将 PUP 基因在染色体上的定位进行可视化。再使用 MCScanX 软件进行陆地棉全基因组范围 内 的 共 线 性 分 析，从 分 析 结 果 中 筛 选 出 含 有PUP基因的共线性区域及所有 PUP基因的重复信息。利用 TBtools中的 Circos图对位于染色体上的PUP基因进行位置与共线性关系的展示。1.5陆地棉PUP基因的结构及蛋白质保守结构域分析从陆地棉基因组 gff3 文件中筛选出 PUP 基因结构信息；利用 MEME（Multiple expectation maximization for elicition）网站对陆地棉 PUP 蛋白进行保守结构域预测，motif sites 设置为 2500 sites，Width 在 6100 wide；总共识别获得 10 个不同的motif，并下载预测得出的 xml 格式文件，利用 TBtools26工具将结果进行可视化。1.6Ka(nonsynonymous)/Ks(synonymous)分析利 用 Tbtools 中 的 Simple Ka/Ks Calculator（NG）程序来计算水稻（Oryza sativa）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、陆地棉（Gossypium hirsutum）的同源 PUP基因的 Ka、Ks、Ka/Ks。1.7顺式作用元件分析利用 TBtools软件从陆地棉基因组数据中提取出 GhPUP 基因起始密码子(ATG)上游 2 000 bp 的启动子序列；在 PlantCARE（https:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网 站 上 进行启动子顺式元件分析；利用“Simple BioSequence Viewer“程序，在TBtools上进行顺式作用元件可视化。1.8陆地棉PUP基因表达分析从 CottonMD（http:/ PUP 家族基因成员的组织表达和不同胁迫条件下的转录组数据，然后运行 TBtools 软件中的 Amazing Heatmap 程序，设置列相标准化和横相聚类，对陆地棉 PUP 基因在不同组织以及不同处理条件下的表达情况进行分析与可视化。2 结果与分析2.1陆地棉PUP家族基因的鉴定结合拟南芥和水稻的 PUP 基因，利用 BLAST方法，在陆地棉的全基因组数据库中鉴定 OsPUP和 AtPUP 的同源序列，通过筛选最终获得 31 个陆地棉 PUP 基因，根据基因位于染色体位置依次命名为 GhPUP1GhPUP31。使用 ExPASy 工具对这 31 个蛋白的分子质量、等电点、基因编号、蛋白长度和在染色体的位置等进行了分析，具体结果如表 1所示，这些 PUP基因编码的蛋白质氨基酸数在168（GhPUP3）472个（GhPUP27），分子质量的大小在 18 374.7852 935.23 u。GhPUP 蛋白家族成员中理论等电点最大的是 GhPUP5蛋白，等电点为9.17，而最小的是 GhPUP9 蛋白，等电点为 6.30，且这 31个蛋白均为疏水性蛋白。表 1 陆地棉PUP家族基因信息Tab.1 Information of PUP family genes in Gossypium hirsutumGhir_A01G011670.1Ghir_A02G001830.1Ghir_A02G019220.1Ghir_A03G023650.1Ghir_A04G012420.1Ghir_A05G022690.1Ghir_A05G022700.1Ghir_A06G010310.1Ghir_A06G014730.1Ghir_A09G020660.1Ghir_A10G003650.1GhPUP1GhPUP2GhPUP3GhPUP4GhPUP5GhPUP6GhPUP7GhPUP8GhPUP9GhPUP10GhPUP1135838516837734635736126537138222339 716.8142 591.9318 374.7842 176.8138 192.4339 160.2239 843.0628 863.8840 839.6542 351.5224 221.277.548.516.558.749.178.538.478.486.309.038.710.5390.3940.8600.3720.6080.6360.5480.8680.5030.4450.576基因 IDGene ID基因名称Gene name氨基酸个数Number of amino acids分子质量/uMolecular weight理论等电点Theoretical isoelectric point亲水性GRAVY985山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期Ghir_A11G008040.1Ghir_A12G010700.1Ghir_A12G013550.1Ghir_D01G012690.1Ghir_D01G012700.1Ghir_D02G001910.1Ghir_D02G025110.1Ghir_D03G000340.1Ghir_D04G016840.1Ghir_D05G015280.1Ghir_D05G022590.1Ghir_D05G022600.1Ghir_D05G022610.1Ghir_D06G010680.1Ghir_D06G015410.1Ghir_D09G008340.1Ghir_D09G020130.1Ghir_D11G008030.1Ghir_D12G010890.1Ghir_D12G020810.1GhPUP12GhPUP13GhPUP14GhPUP15GhPUP16GhPUP17GhPUP18GhPUP19GhPUP20GhPUP21GhPUP22GhPUP23GhPUP24GhPUP25GhPUP26GhPUP27GhPUP28GhPUP29GhPUP30GhPUP3136436430335834838538534934540832737434136637147237837136833239 884.6839 820.7833 172.8239 658.7338 413.8542 560.9543 162.7838 450.6538 114.4044 959.0635 725.4441 093.3737 605.0540 182.1040 885.7252 935.2342 021.0740 858.7540 440.5836 062.586.518.748.247.549.008.788.278.339.097.958.688.288.428.397.599.058.826.518.628.360.6130.6220.7490.5390.7550.3960.3250.6650.6340.6740.7830.4760.4280.6890.5030.4020.4360.5390.6580.746基因 IDGene ID基因名称Gene name氨基酸个数Number of amino acids分子质量/uMolecular weight理论等电点Theoretical isoelectric point亲水性GRAVY2.2陆地棉PUP基因的系统进化分析为了研究陆地棉 PUP 家族基因的起源和进化，根据 31 个陆地棉 GhPUP 家族成员的蛋白序列、20个拟南芥AtPUP家族成员的蛋白序列和12个水 稻 OsPUP 家 族 成 员 的 蛋 白 序 列，然 后 利 用MEGA 11软件构建了PUP蛋白在水稻、拟南芥和陆地棉之间的系统进化树，结果如图1所示。绿色方块为拟南芥 PUP蛋白，黄色圆形为陆地棉 PUP蛋白，蓝色三角形为水稻 PUP蛋白The green squares represented Arabidopsis PUP proteins,the yellow circles represented Gossypium hirsutum PUP proteins,and the blue triangles represented Oryza sativa PUP proteins图 1陆地棉、水稻和拟南芥 PUP蛋白系统进化关系Fig.1Phylogenetic relationship of PUP proteins in Gossypium hirsutum，Oryza sativa，and Arabidopsis续表 1 陆地棉PUP家族基因信息Tab.1（Continued）Information of PUP family genes in Gossypium hirsutum986陈云等：陆地棉 PUP家族基因的鉴定及表达分析由图1可知，63个PUP基因被分成了4个分支，分别命名为Group1Group4。其中，陆地棉 PUP 保守域序列在各个分支中的具体分布情况为：Group1亚家族中共有 15 个；Group2 亚家族中共有 12个；Group3亚家族有 4个；Group4亚家族中没有陆地棉PUP。通过比较这4个亚家族，可观察到 Group1 成员最多，且涵盖 3 个物种；Group2、Group3 成员数目逐渐降低，但均涵盖 3 个物种；Group4 只有 1 个AtPUP 成员，可能由于该基因在进化的过程中不保守，蛋白序列差异较大，可能行使特别的功能。2.3陆地棉PUP基因结构及保守结构域分析为了进一步了解陆地棉 PUP 基因的功能，单独使用陆地棉 PUP 蛋白进行了系统进化分析，并利用MEME、NCBI-CDD、TBtools等软件对这31个陆地棉 PUP 蛋白的基因结构和保守结构域进行了分析，结果如图2所示，单独使用陆地棉PUP蛋白构建的进化树与使用陆地棉、水稻和拟南芥 PUP 蛋白构建的进化树的分支情况存在一定的差异，单独使用陆地棉 PUP 蛋白构建的进化树将 31个蛋白分成 3 支。第 1 支有 16 个成员（GhPUP6、GhPUP18、GhPUP19、GhPUP23、GhPUP22等），第2支只有2个成员（GhPUP8、GhPUP25），第 3 支包含 13 个成员（GhPUP9、GhPUP26、GhPUP30等）。基因结构的分析结果显示，这些陆地棉PUP基因大多数只有1个内含子，少数有 2个（GhPUP5、GhPUP24、GhPUP28）或 3 个内含子(GhPUP31)，也有少数基因没有内含子(GhPUP2、GhPUP3、GhPUP4、GhPUP17、GhPUP18)。保守结构域的分析结果显示，除了motif 9 外（只有 11 个基因包含 motif 9），大多数基因都包含 motif 1motif 10。GhPUP8和 GhPUP25不 含 motif 5、motif 7 和 motif 9。GhPUP14 和GhPUP31 不含 motif 5 和 motif 9。GhPUP3 这个基因所含的 motif数量最少，只有 4个。2.4陆地棉PUP基因在染色体上的定位与基因复制分析由于基因在染色体上的分布在一定程度上影响了基因的功能，因此，对这 31个 GhPUP基因在染色体上的定位进行了分析（图 3）。结果显示，31个GhPUP 基因分布在 19 条染色体上，图中及下文只涉及有 GhPUP分布的染色体。Ghir_D05染色体上的 PUP 基因最多，为 4个；其他染色体均有 12 个PUP基因的分布。从结果可以看出，少数基因存在基因成簇现象，比如 GhPUP6/7 位于 Ghir_A05 染色体的相近位置，GhPUP15/16 位于 Ghir_D01 染色体的相近位置，GhPUP22/23/24 位于 Ghir_D05染色体的相近位置。左侧为 GhPUP进化树；中间为 GhPUP蛋白质的保守结构域；右侧为 GhPUP基因结构，灰线为内含子The GhPUP phylogenetic tree was on the left;the conserved domain of GhPUP protein was in the middle;the GhPUP gene structure was on the right,and the gray line was the intron图 2GhPUP蛋白进化树、基因结构及保守结构域分析Fig.2The phylogenetic tree，gene structure，and conserved domain analyses of the GhPUP protein987山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期复制事件在植物进化过程中起着至关重要的作用，串联复制和片段复制是导致基因组扩增和复杂性增加的重要过程27-28。对 31 个陆地棉 PUP 基因的基因重复现象进行了分析，如图 4 所示，陆地棉基因组中共有 17 个同源性的 PUP 基因对，涉及25个 PUP 基因，其中一对一重复的基因对有 8个，一 对 多 的 基 因 对 有 3 个，比 如 GhPUP21 分 别 与GhPUP26 及 GhPUP27 在 2 个不同的共线区域表现为重复基因。GhPUP 基因的复制类型基本上都是片段重复，没有同一条染色体多个同源 PUP 基因成簇的现象出现。红线相连的基因为在全基因组复制或片段复制区域中的重复 PUP基因Red-linked genes were duplicate PUP genes in whole genome replication or fragment replication regions图 4PUP基因在陆地棉基因组中的基因复制事件Fig.4Gene replication events of PUP genes in Gossypium hirsutum genome左边的标尺表示陆地棉染色体的长度The ruler on the left indicated the length of the chromosomes in Gossypium hirsutum图 3陆地棉PUP基因在染色体上的分布Fig.3Chromosomal distribution of PUP genes in Gossypium hirsutum988陈云等：陆地棉 PUP家族基因的鉴定及表达分析2.5拟南芥、水稻、陆地棉PUP基因共线性分析为了探究拟南芥、水稻、陆地棉中的 PUP 家族基因的进化关系，通过 MCScanX 软件对 3 个物种中的PUP基因进行了共线性分析。从图5可以看出，与拟南芥和水稻具有共线性的基因对分别有 3、4 个，说明陆地棉与这 2个物种的 PUP 基因同源性较低。2.6拟南芥、水稻、陆地棉PUP家族基因的遗传变异分析Ka/Ks 表示的是非同义替换率（Ka）和同义替换率（Ks）之间的比例，这一比值可以推断编码该蛋白的基因是否遭受了选择压力29。Ka 为非同义替换率，表示在进化过程中碱基的变化会改变蛋白的编码；Ks为同义替换率，表示因密码子简并性的存在，在进化过程中碱基的突变不会改变最终蛋白的编码。如果 Ka/Ks1表示正向选择，Ka/Ks=1 为中性选择29。为了进一步了解陆地棉 PUP 基因在分化中选择压力的程度，对 24 个同源基因对的非同义（Ka）和同义（Ks）值进行了评估。表 2 展示了所有与陆地棉 PUP 同源的 PUP基因对之间的 Ka和 Ks，因个别基因对最终的计算数值为 NA，故没有展示出来。由表 2 可知，所有可计算的 PUP 基因对的 Ka/Ks 均小于 1，且有些基因对的数值远小于 1，比如第一组值为0.165，说明在这 3 个物种的进化过程中 PUP 基因受自然选择的方式为净化选择，PUP 基因在进化过程中功能保守。拟南芥、水稻、陆地棉中的 PUP基因共线性分析，陆地棉基因组只展示有共线性基因对分布的染色体，其余 2个物种完整染色体均有展示；灰色线为共线块，棕黄色线表示不同物种间的 PUP共线基因对，红色三角代表与其他 2个物种具有共线性的 GhPUP在染色体上的分布The collinear analysis of PUP genes in Arabidopsis,Oryza sativa and Gossypium hirsutum.The Gossypium hirsutum genome only showed chromosomes with the distribution of collinear gene pairs,and the complete chromosomes of the other two species were displayed.The gray lines were collinear blocks,the brownish-yellow lines represented PUP collinear gene pairs between different species,and the red triangle represented the distribution on chromosomes of GhPUP that was collinear with the other two species图 5不同物种PUP基因共线性分析Fig.5Collinearity analysis of PUP genes in different species表 2 陆地棉PUP家族基因与拟南芥、水稻的同源PUP基因之间 Ka/Ks的比率Tab.2 The Ka/Ks ratios of PUP family genes in Gossypium hirsutum and PUP genes homologous with Arabidopsis and Oryza sativaSeq_1GhPUP1GhPUP1GhPUP1GhPUP2GhPUP3GhPUP4GhPUP5GhPUP6GhPUP9GhPUP8GhPUP9Seq_2GhPUP6GhPUP15GhPUP23GhPUP17GhPUP19GhPUP18GhPUP20GhPUP22GhPUP21GhPUP25GhPUP26Ka0.123 664 0640.002 449 9820.126 542 7360.013 718 5880.067 190 2690.007 517 4110.012 917 4340.039 652 7140.354 616 0860.013 508 1740.008 400 088Ks0.749 314 5860.056 707 1620.799 516 1590.034 193 9560.157 060 9730.037 165 3610.105 436 4630.085 536 7842.794 892 9940.036 323 5710.041 106 177Ka/Ks0.165 036 2420.043 204 0980.158 274 1450.401 199 1970.427 797 3580.202 269 2770.122 513 9210.463 574 9920.126 880 0230.371 884 5410.204 350 984Seq_1GhPUP9GhPUP10GhPUP21GhPUP21GhPUP29GhPUP8GhPUP9GhPUP25GhPUP6GhPUP6GhPUP23Seq_2GhPUP27GhPUP28GhPUP26GhPUP27GhPUP30AtPUP5AtPUP6AtPUP5OsPUP2OsPUP1OsPUP2Ka0.323 547 8190.009 380 6190.349 928 9860.378 836 4960.105 367 3460.191 692 7470.336 412 4950.219 673 9260.464 894 9640.527 508 6710.445 806 390Ks1.924 331 2770.025 816 9313.265 668 2651.671 877 8790.724 823 7753.477 943 8752.116 831 2142.696 788 5952.195 281 5154.166 095 4153.989 264 962Ka/Ks0.168 135 1970.363 351 4220.107 153 8680.226 593 4020.145 369 6050.055 116 6880.158 922 6820.081 457 6000.211 770 0900.126 619 4410.111 751 512989山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期2.7陆地棉PUP顺式作用元件分析顺式作用元件是特定转录因子的结合位点，它决定转录的起始或抑制。因此，这些顺式作用元件是基因组中必不可少的基因结构。因此，为进一步了解 GhPUP 蛋白的潜在功能与调控作用，通过PlantCARE 和 TBtools对基因上游 2 000 bp的序列中 的 顺 式 作 用 元 件 进 行 了 筛 选 和 分 析。每 个GhPUP 基因至少含有 5 个顺式作用元件，一共有18个元件出现在 GhPUP 启动子区域（图 6，不同的色框代表不同的元件）。这些元件可分为 3类，分别是激素应答、胁迫/物理应答以及与植物生长发育相关的元件。比如，CGTCA-motif参与应答 MeJA信号通路。结合左边的进化树可知，分在同一组的GhPUP 成员有着较为相似的顺式作用元件种类与数目，例如，GhPUP6和 GhPUP22都有 CAT-box。几乎每个成员都有 ARE 这个元件，但同时每个成员 也 有 其 不 同 于 其 他 成 员 的 特 殊 元 件，比 如GhPUP21有 GARE-motif，而其他成员少有。2.8陆地棉PUP基因的表达模式分析2.8.1陆地棉 PUP 基因在不同组织中表达模式分析为了研究 PUP 基因在陆地棉不同组织中的表达模式，从陆地棉基因表达芯片中筛选出了 25 个PUP基因的组织表达数据。利用 TBtools软件中的Heatmap 程序将 GhPUP 基因在不同组织（根、茎、叶、花瓣、花药、苞片、雌蕊、萼片、花托以及开花前后不同天数的纤维和胚珠）中的表达情况进行了分析。图7是PUP基因在根、茎、叶、花瓣、花药、苞片、雌蕊、萼片、花托中的表达图谱，结果显示，依据组织表达情况，这 25 个 PUP 基因可以分为 8 支（图7）。第 1支包含 4个基因，这 4个基因主要在花器官中表达，其中，GhPUP10基因主要在花瓣、花药、苞片、雌蕊和萼片中表达，GhPUP12 和 GhPUP29 基因在花药中有较高表达，GhPUP14基因在苞片、萼片和花托中有一定的表达。第 2 支包含 2 个基因（GhPUP5 和 GhPUP20），这 2 个基因在根、茎和花托中表达量较高。第 3 支和第 4 支都只有 1 个基因，分别是 GhPUP25 和 GhPUP22，它们分别在叶和花瓣中优势表达。第5、6、7支总共包含15个基因，这15个基因在各组织中的表达量都比较低。第8支中的 2个基因在茎中有一定的表达，在其他组织中的表达量很低。同时对以上 25 个基因在不同发育时期的棉纤维和胚珠中表达情