口蹄疫流行现状及防控措施.pdf

山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 42 口蹄疫流行现状及防控措施 赵家昌1，俞 挺2，孙建国1，魏爱鹏1，郑新颖2，朱方舟2，余路瑶3，罗 前4，苏正军1*（1.董家口港海关，山东 青岛 266000；2.青岛海关，山东 青岛；3.仙桃海关，湖北 仙桃；4.上海动物园，上海）摘要：口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）引起的一种动物传染病，传播速度快、发病急、死亡率高，给全球畜牧业和经贸往来造成严重的负面影响。本文结合近年来口蹄疫最新研究进展及流行情况，从口蹄疫病原学、流行病学、临床症状、实验室检测方法等方面进行综述，并结合实际情况提出防控措施，以期为口蹄疫的防控提供参考。关键词：口蹄疫病毒；流行病学；检测方法；防控措施 中图分类号：S855.3 文献标识码：B 文章编号：1007-1733（2023）08-0042-05 1514年，意大利威尼斯记载了牛可能感染口蹄疫的事实，并在1897年被证实是由可过滤病毒FMDV引起的1。全世界100多个国家和地区都曾暴发过口蹄疫，2022年印度尼西亚暴发大规模口蹄疫疫情，引发国际社会广泛关注。口蹄疫被世界动物卫生组织（WOSH，原缩写OIE）列为必报动物疫病，也是一、二、三类动物疫病病种名录一类动物疫病，中华人民共和国进境动物检疫疫病名录中的一类传染病2。受宗教文化、政治经济、动物疫病防控体系的影响，我国周边国家口蹄疫疫情复杂，随着我国同周边国家经贸往来不断加深，口蹄疫疫情输入风险日益严峻。本文从口蹄疫病原学、流行病学、检测方法等方面进行了综述并提出了建议。1 病原学 口蹄疫病毒是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridac）口蹄疫毒属（Aphthovirus），病毒无囊膜，结构呈二十面体型3。基因组全长约8 500 nt，包括5端非编码区（5UTR）、开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）、3端非编码区（3UTR）及Poly A。ORF长约6 400 nt，编码病毒蛋白，包括Lpro基因、P1基因、P2基因和P3基因。P1 基因编码结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4，P2基因编码非结构蛋白2A、2B、2C，P3基因编码非结构蛋白3A、3B、3Cpro、3Dpol4。口蹄疫病毒目前共有7个血清型，分别是O、A、C、Asia-1、SAT1、SAT2、SAT3型，病毒各个血清型之间差异较大，免疫交叉保护较弱5。同一血清型内不同的毒株也存在一定的差异，将不同地域分离的毒株序列结合遗传进化进行关联分析可以对同一血清型口蹄疫毒株进行分型，称为拓扑型，如流行范围较广的O型口蹄疫可分为11个拓扑型，而Asia-1型仅有1个拓扑型6。口蹄疫病毒对温度、酸碱条件敏感。在低温条件下存活时间较长，但对高温和紫外线敏感，在60，15 min或100，3 min的条件下可以灭活病毒，紫外照射1 h即可灭活病毒；环境pH 5.5、1 min可灭活90%的病毒，当pH 5.0时1 s即可灭活90%的病毒7。2 流行病学 2.1 易感动物 FMDV宿主种类繁多，可感染70多种哺乳动物。主要感染偶蹄目动物，如牛、水牛、牦牛、猪、骆驼、绵羊、山羊等，也可以感染非偶蹄目动物，如犬、刺猬、熊、大象、袋鼠、海狸 *通讯作者 2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）疾病防治疾病防治疾病防治疾病防治 43 鼠和水豚等；在实验条件下大鼠、小鼠、豚鼠等也可以被感染8-9。2.2 传播途径 动物主要通过呼吸道和消化道感染口蹄疫病毒。健康动物直接接触带毒病畜的粪便、分泌物，饮用或食用被口蹄疫病毒污染的水源、泔水感染口蹄疫；口蹄疫病毒也可以通过空气传播，在空气中可以形成气溶胶，在海平面上 以250 km/h或者在陆地上以60 km/h的速度远距离传播10。2.3 口蹄疫流行情况 口蹄疫先后在世界100多个国家和地区被报道，大规模的暴发会给当地畜牧业造成重创。1997年我国台湾地区暴发口蹄疫疫情造成400多万头牲畜被屠杀；2001年英国暴发大规模口蹄疫疫情并波及德国、荷兰等国家，累计屠宰牲畜超630万头，造成直接损失超过200亿英镑11。2020年以来，口蹄疫仍在全世界广泛流行，亚洲和非洲一直是FMD重灾区，FMD流行情况复杂；大洋洲、美洲持续保持无FMD状态；欧洲只有俄罗斯部分地区出现口蹄疫疫情。根据世界动物卫生组织（WOAH）数据统计，2020年全球共有25个国家向WOSH通报了口蹄疫疫情，其中非洲国家14个，亚洲国家10个，欧洲国家1个，暴发口蹄疫的血清型为A、O、Asia、SAT1、SAT2五种血清型；2021年全球共有23个国家向WOSH通报发生口蹄疫，其中非洲国家9个，亚洲国家13个，欧洲国家1个，暴发口蹄疫的血清型为A、O、Asia、SAT1、SAT2、SAT3 6种血清型；2022年上半年，共有12个国家向WOSH通报国内暴发口蹄疫疫情，其中非洲国家7个，亚洲国家5个，暴发口蹄疫的血清型为O、SAT2、SAT3 3种血清型。国内口蹄疫疫情近年来呈现整体平稳、局部散发的趋势。2020年至今共发生9起口蹄疫疫情，涉及5个省市，发病动物为猪、牛、牦牛。国内口蹄疫流行毒株较复杂，主要流行O型和A型口蹄疫病毒，O型口蹄疫有Ind-2001e、Mya-98和CATHAY等毒株，A型为Sea-97毒株，2021年在边境地区监测到A型的A/Sea-97境外分支病毒12。3 临床症状 动物感染口蹄疫临床症状可以从表现不明显、轻微到严重不等，临床体征的严重程度因毒株而异，并与动物的品种、年龄和免疫程度有关9。易感动物感染后常出现跛行或卧地不起，唇部、牙龈、蹄叉、乳房等部位出现水泡，发病后期水泡破溃、结痂，严重者蹄壳脱落13。口蹄疫感染发病率可达100%，大多数成年动物在23周内可以恢复，成年动物的死亡率一般较低；幼畜的死亡率较高，心肌炎是幼畜感染口蹄疫主要死因，病理解剖死亡动物心肌表面呈现灰白色条文，俗称“虎斑心”13。4 诊断监测技术 口蹄疫发病率高，临床症状和猪水泡病毒、塞内卡谷病毒、水泡性口炎病毒等疫病高度相似，仅通过临床症状无法做出准确判断，通常需要结合实验室检测进行确诊。4.1 病毒分离技术 病毒分离技术是检测口蹄疫病毒的“金标准”，包括动物接种试验和细胞培养试验13。动物接种试验是将病料接种25日龄的乳鼠颈背部，观察乳鼠存活情况。如果病料中存在口蹄疫病毒，乳鼠会在12 h后出现FMDV感染后的特征性症状，25 d时间内死亡。细胞培养试验常用幼仓鼠肾细胞系、仔猪肾细胞系、犊牛甲状腺原代细胞进行口蹄疫病毒培养，观察细胞病变情况。病毒分离技术主要用于口蹄疫病毒毒株的分离，为后续科学研究、流行病学调查、血清型鉴定奠定基础。由于实验过程复杂，耗费较大，临床运用并不广泛。4.2 血清学检测技术 血清学检测技术是基于抗原与抗体特异性结合的性质来检测病毒，实验室常用的血清学检测技术包括补体结合试验（CFT）、病毒中和试验（VNT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等16。（1）补体结合试验是将待检测样品与特异性抗体混合后加入定量补体，在抗原抗体特异性反应山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 44 的过程中会消耗补体，充分反应后加入定量的红细胞与剩余补体反应，补体具有促进溶血的作用，如果红细胞出现溶血现象则说明样品中含有口蹄疫病毒。CFT灵敏度不高，容易受到样品中补体干扰物质的影响且CFT对待检测样本要求较高，只能检测水泡液或者新鲜的水泡上皮组织，应用范围受到限制。（2）病毒中和试验的原理是病毒特异性抗体可以和病毒结合，使病毒侵袭能力下降。VNT灵敏度和准确度高，由于使用活病毒进行试验，所以对实验条件要求较高，需要专门的细胞培养设备、高安全等级实验室，且试验周期较长，推广普及难度较大。（3）ELISA在疫苗免疫效果评价、鉴定口蹄疫感染、口蹄疫病毒分型方面都发挥着重要作用。马军武等14针对我国流行的口蹄疫病毒建立了O型和Asia-1型口蹄疫液相阻断ELISA（LPB-ELISA）。试验表明，O型口蹄疫液相阻断ELISA的特异性为98%，灵敏性为98%；Asia 型口蹄疫液相阻断ELISA的特异性为98%，灵敏性为100%。LPB-ELISA操作简便，适用于大批量血清样本的检测，对于群体免疫抗体监测发挥重要作用，但是存在假阳性较高的缺陷。许智强、李敏杰等15-16基于单克隆抗体（MAb）技术建立了检测O型、A型FMDV抗体的固相竞争ELISA（SPCE），并与液相阻断ELISA方法、病毒中和试验进行相关性比较，实验证明该方法特异性良好、灵敏度较高。对非结构蛋白抗体检测可以作为自然感染的鉴别方法。孙雨等17利用大肠杆菌原核表达系统表达3A-3B1-3B2融合蛋白，建立了羊血清口蹄疫病毒非结构蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，对300份临床样本进行检测，并与国内销售的口蹄疫非结构蛋白抗体检测试剂盒进行比较，总符合率为95.33%。4.3 分子生物学检测技术 分子生物学检测技术主要基于核酸碱基互补配对的原理，目前主要有 聚合酶链式反 应（polymerase chain reaction，PCR）和现场快速检测技术（point-of-care testing，POCT）两大类。马震原等18建立了鉴别O型、A型、Asia 型三重RT-PCR检测方法可以实现对3种血清型口蹄疫病毒进行诊断鉴别，最低检测限度为100拷贝/L，灵敏度较好，检测特异性良好。史喜菊等19建立了检测及鉴别诊断口蹄疫病毒和水泡性口炎的多重荧光RT-PCR检测方法，针对口蹄疫病毒3D基因保守区段和VSV的L基因设计了通用型引物，可以实现对3种病毒的特异性检测，对O型、A型、Asia 型感染样品检测符合率达100%。林彦星等20建立了同时检测塞内卡病毒和口蹄疫病毒的双荧光RT-PCR检测方法，最低可检测到塞内卡病毒和口蹄疫病毒核酸质量浓度分别为1.3510-5 mg/L和1.6810-5 mg/L，对116份已知的临床样品进行检测，结果与参比方法一致。PCR检测方法对操作人员、仪器设备和实验室环境要求较高，限制了它的应用场景。因此，现场快速检验技术因其检测速度快、操作简便、成本低廉等优势发展迅速。快速检测技术主要依靠等温核酸扩增技术，主要包括RT-LAMP、RT-RPA等。谢佳芮等21通过分析比对全球O型、A型、Asia 型口蹄疫基因序列，针对FMDV 3D基因序列设计引物建立了RT-LAMP检测方法，采取反应前用石蜡密封PicoGreen染料，实现了免开盖可视化判定检测结果，最低可检 测3.4106 ng/L的病毒RNA，对94份临床样本进行检测对比，该方法与RT-PCR、RT-qPCR方法检测的符合率为82.8%。刘立兵等22针对口蹄疫病毒3D基因保守序列设计引物，使用exo探针建立实时荧光RT-RPA等温检测方法，能够在40条件下20 min内对口蹄疫病毒进行特异性检测并获得结果，对含有灭活口蹄疫病毒的模拟临床样品进行检测，准确度为34.9%。该检测方法配备使用重量较轻的便携式荧光检测仪Genie，对实验条件要求低，为基层现场检验提供了便利。5 讨论及建议 口蹄疫在世界范围内曾经多次大规模暴发，已经演变成“政治经济病”，国家一旦暴发口蹄疫疫情，相关动物及动物产品的出口将受到严格的限制。外防口蹄疫输入、内防口蹄疫暴发对于保障国内畜禽产业健康发展，畅通国际经贸往来2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）疾病防治疾病防治疾病防治疾病防治 45 有着重要的意义。5.1 加强进境检疫，防止口蹄疫传入 5.1.1 强化风险分析 及时关注并收集国外口蹄疫流行情况，利用大数据等信息化手段建立进境口蹄疫疫情预警分级系统。禁止从口蹄疫流行国家或地区进口相关产品；按照风险等级对口蹄疫流行潜在风险国家进行分级管理，优化进口相关产品口蹄疫病原检测比例。5.1.2 加强进境动物及其产品检疫 加强境外进境动物预检工作，预检兽医应加强对农场检疫、隔离场检疫、实验室检测的监管，确保预检动物的健康状况；严厉打击走私、夹藏等非法行为，防范口蹄疫通过非法渠道传入我国；应用GIS等技术手段探索建立跨境动物疫情区域化管理新模式，在有效防范动物疫病传入的同时为贸易提供便利化措施23。5.1.3 提升口岸实验室检测能力 口岸实验室检测是确保国门生物安全的最后一道防线。强化实验室生物安全管理，规范实验室布局避免实验室交叉污染，严格按照国际航空运输联盟IATA的危险品规则运送待检样品避免病毒泄露；加强快速检测技术的开发与应用，结合CRISPR新技术建立新一代生物传感诊断平台，为口岸防控口蹄疫输入提供有力保障。5.2 规范养殖管理，预防口蹄疫发生 5.2.1 加强动物免疫及定期监测 严格按照国家动物疫病强制免疫指导意见（20222025年）要求制定养殖场动物免疫程序对动物群体进行免疫，建立易感动物免疫屏障，预防口蹄疫发生；定期开展畜群口蹄疫监测，确保易感动物口蹄疫免疫抗体合格率维持在70%以上，筛查隐性带毒或野毒感染情况。5.2.2 加强养殖场日常卫生管理 开展环境消毒工作，每年定期对养殖场进行消毒；对日常生产用具、医疗器械、饲草、垫料等进行消毒，避免人为传播疾病；做好蚊蝇等昆虫的杀灭工作，避免昆虫媒介传播疫病；定期开展粪便除污工作，确保养殖场内部卫生状况干净整洁。5.3 加强国际合作，形成口蹄疫防控合力 我国周边国家均有口蹄疫疫区，有效防控口蹄疫需加强区域国家合作。在中国-东南亚口蹄疫控制行动计划的基础上，借鉴南美等地区净化口蹄疫成功经验，结合区域实际情况，深化在口蹄疫基础研究、口蹄疫新型疫苗及快速诊断检疫技术研发、口蹄疫疫情信息共享、区域内口蹄疫无疫区建设等方面的合作，形成口蹄疫防控合力。参考文献 1 Jamal SM,Belsham GJ.Foot-and-mouth disease:past,present and future.Veterinary research,2013,44（1）:116.2 刘亚丽,丁耀忠,马小元,等.口蹄疫病毒的抗原结构学的研究进展J.中国预防兽医学报,2016,38（3）:253-256,4 3 Li K,Wang C,Yang F,et al.Virus-Host Interactions in Foot-and-Mouth Disease Virus InfectionJ.Frontiers in Immunology,2021,12:571509.4 刘庆军,张永光.口蹄疫病毒基因组结构及其功能J.中国畜牧兽医文摘,2006（2）:24.5 何随彬,金盈宇,龚志亮,等.口蹄疫疫苗最新研究进展J.上海畜牧兽医通讯,2019（2）:30-32,35.6 孙映雪,朱琳,陈伟,等.2018年全球口蹄疫流行状况分析J.中国动物检疫,2019,36（6）:49-55.7 林太明.猪口蹄疫的特点与防治J.猪业科学,2009,26（2）:68-69.8 Heng NH,Wilson DW.Risk assessment on the importation of milk and milk products（excluding cheese）from countries not free from foot and mouth disease.Revue scientifique et technique（International Office of Epizootics）,1993,12（4）:1135-1146.9 Bablanian GM,Grubman MJ.Characterization of the foot-and-mouth disease virus 3C protease expressed in Escherichia coliJ.Virology，1993,197（1）:320-7.10 Mason PW,Rieder E,Baxt B.RGD sequence of foot-and-mouth disease virus is essential for infecting cells via the natural receptor but can be bypassed by an antibody-dependent enhancement pathway.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994,91（5）:1932-6.11 郭志儒,金宁一.2001年英国口蹄疫流行回顾J.中国兽医学报,2002（1）:80-83,89.12 农业农村部.国家动物疫病强制免疫指导意见（20222025年）.2022-01-04.（下转49页）2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）疾病防治疾病防治疾病防治疾病防治 49 败。本试验分别采集了病鸡的支气管内容物和气囊内容物作为分离样品。（3）鸡毒霉形体生长对水质和pH值要求较高，需采用三蒸水或去离子水，本试验采用去离子水。琼脂的质量可影响鸡毒霉形体菌落的大小；血清提供胆固醇和各种脂肪酸；酚红的质量可影响鸡毒霉形体的生长。（4）鸡毒霉形体与大肠杆菌混合感染时，分离比较困难，需多次移植分离，工作量较大，且不易分离成功。由于鸡毒霉形体缺乏细胞壁，在培养中加入青霉素抑制细菌的生长，制霉菌素抑制霉菌的生长10。但抑菌剂的浓度应适宜，此外，培养用的玻璃器皿洁净程度也影响鸡毒霉形体生长。6 结论 通过病鸡分离获得鸡毒霉形体，药敏实验发现鸡毒霉形体对泰乐菌素、红霉素和北里霉素高度敏感，庆大霉素、替米考星为中度敏感，对链霉素、多粘菌素、磺胺二甲嘧啶、青霉素、乳酸环丙沙星不敏感。养殖户使用北里霉素、红霉素治疗后，该养殖场的病鸡情况明显得到控制。参考文献 1 王红宁.禽呼吸系统疾病M.北京:中国农业出版社,2002.2 丁银巧,乌尼,郝永清,等.内蒙古地区鸡源霉形体的分离和鉴定J.内蒙古农牧学院学报,1998（1）:36-41.3 李连任,李希广.鸡毒支原体病的诊断与防制J.甘肃畜牧兽医,2004（1）:34-35.4 林曦主编.家畜病理学M.3版.北京:中国农业出版社,2000.5 艾武,牟建青,刘玉山,等.鸡毒支原体敏感药物的筛选J.中国兽药杂志,2003（5）:48-49.6 姚火春.兽医微生物试验指导M.2版.北京:中国农业出版社,2002.7 郭锐.鸡毒霉形体的分离鉴定及其16S/23SrRNA基因间隔区、TM-1基因序列差异分析D.武汉:华中农业大学,2006.8 马兴树.禽传染病实验诊断技术M.北京:化学工业出版社2006.9 曾振灵,王燕,王令.三种抗菌药体外对鸡败血支原体的敏感性J.中国预防兽医学报,2002（2）:127-129.10 陈天寿.微生物培养基的制造与应用M.北京:中国农业出版社,1995.（收稿日期：2022-12-13）（上接45页）13 GB/T 18935-2018,口蹄疫诊断技术S.北京:中国标准出版社.14 马军武.O型和亚洲1型口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测方法研究和试剂盒研制P.甘肃省,中国农业科学院兰州兽医研究所,2008-12-18.15 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