第五章 色谱法-2.doc

§4 高效液相色谱法
一、概述
1、定义
在经典液相色谱法基础上，吸收了气相色谱法的理论，并采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的色谱技术称为高效液相色谱法，又称为高压液相色谱法。
2、特点
①高压 由于液体的粘度比气体大得多，所以，当液体流动相通过色谱柱时会受到很大的阻力，需采用高压泵对载液施加压力，压力可达100～350×105Pa。
②高速 流动相在柱中的流速大，分离速度快，一次分析只需几分钟至几十分钟就能完成。分析时间比经典液相色谱法短得多，与气相色谱法近似。
③高效 使用了新型固定相，柱效远高于气相色谱法。另外，流动相可进行选择，有单溶剂、多元溶剂并可任意调配比例，可改变流动相的组成、极性、pH值等性质，因此改善了分离效果。而气相色谱法的流动相种类少，性质相近，且与组分之间不发生特殊作用，故改变载气种类不能很大地改善分离效果。该法分离温度远低于气相色谱法，更有利于分离。
④高灵敏度 采用高灵敏度的检测器，提高了分析灵敏度，如紫外检测器的灵敏度可达5×10－10g·mL－1。
⑤应用范围广 一般对能制成溶液的试样均能分析，尤其适用于分析高沸点、大分子、热稳定性差、强极性化合物和各种离子型化合物，如分离分析氨基酸、蛋白质、维生素、生物碱、糖类、农药等。而气相色谱法无法分析高沸点（300℃以上）或不能汽化的物质。
⑥液相色谱易实现分离后样品中各组分的收集（高纯物制备）。

二、 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪包括高压输液泵、梯度淋洗装置、进样装置、色谱柱、检测器和记录系统，见图。
贮藏器中贮存的流动相经过高压泵送到色谱柱冲洗柱子，当柱子平衡而且基线平直后，试样用注射器进入进样口，由流动相把试样送到色谱柱进行分离，分离后的组成由检测器检测，输出的信号通过放大器放大后用记录仪记录下来。若需进行进一步分析，在色谱柱出口可将流出物收集起来。
1、高压输液泵
高压输液泵是用来输送流动相的，它是高效液相色谱仪的重要部件。按泵的性质分为恒流泵和恒压泵两类。
恒流泵： 恒流泵是目前使用最多的，有往复泵和螺旋泵。
往复泵使用广泛，它的优点是输出流量恒定，且与流动相的粘度及色谱柱的阻力无关，死体积小，保留值的重复性好，并适合于梯度淋洗，缺点是输出液流量有脉动。
恒压泵： 常用的恒压泵为气动放大泵，输出压力恒定，流量无脉动，能迅速获得高压，适合于色谱柱的填充，价格低；缺点是流量与流动相粘度和色谱柱的阻力有关，所以流量不恒定；泵的腔体大，改变流动相较麻烦，不适宜于梯度淋洗。
2、梯度淋洗装置
对于某些复杂样品，组分的值范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时往往不能满足要求，可采用梯度淋洗——即在分离过程中，组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂，按一定程序连续改变配比、极性、pH值和离子强度，从而达到提高分离效果和分析速度的目的，梯度洗脱技术类似于气相色谱中的程序升温技术。两者都是为了使各组分在最佳值下流出柱子（不同的是程序升温通过改变柱温，而梯度淋洗是通过改变流动相）。
梯度淋洗有两种装置：一种是低压梯度，在常压下按一定程序将不同的溶剂混合后再用高压泵输入色谱柱；另一种是高压梯度，用两个高压泵将不同的溶剂按一定比例压入混合室混合，再送入色谱柱。
3、进样装置
将样品送入色谱柱中进行分离。由于高效液相色谱柱子较短（一般小于0.3m），固定相颗粒较细，进入柱中的样品在流动相中扩散越厉害，则色谱峰就越宽，因此，进样时要求样品在到达柱头前，不与流动相相混合，直接注射到柱头中心即所谓“点进样”。进样方式通常有两种：一种是注射器进样，同气相色谱法，优点是装置简单，可改变进样量，缺点是不能承受高压；另一种是进样阀进样，与气相色谱法中的六通阀一样，优点是能承受高压，重现性好，易于自动化，缺点是改变进样体积时较麻烦。
4、色谱柱
色谱柱是色谱分离的核心。常采用填充柱，固定相同气相色谱法，此处介绍色谱柱管。
要求柱管耐高压、耐腐蚀。一般采用厚壁的玻璃管或不锈钢管制成，柱内径为1～6mm，柱长为15～30cm，直形柱。
5、检测器
检测器分为两类
通用型检测器（总体性质检测器）：它是连续测定柱后流出液（流动相加溶质）总的物理性质的变化，如示差折光检测器、电导检测器等。因适用范围广，但是由于它对溶剂（流动相）也有响应，因此易受温度、流量变化的影响，造成较大的噪声和漂移，不能用于梯度淋洗，灵敏度较低，不适于痕量分析。
选择性检测器（溶质性质检测器）：它是测定流出液中溶质（待测组分）的物理性质的变化，对流动相无信号，如紫外吸收检测器和荧光检测器等。这类检测器只对某些待测物质有响应，灵敏度高，受外界影响小，可用于梯度淋洗，但应用范围受限制。
a、紫外可见吸收检测器
高效液相色谱仪中使用最广泛的选择性检测器。作用原理是待测组分对特定波长的紫外或可见光有选择性吸收，适合于紫外或可见光区有吸收的溶质的测定。检测器输出信号的大小即吸光度与组分浓度成正比。分有固定波长和可变波长两类
优点：灵敏度高；选择性好；对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗；线性范围宽（达105），能同时检测主要成分和痕量成分。缺点是只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，要求流动相在测定波长下不能有吸收。
b、示意折光检测器
示差折光检测器是通用型检测器，作用原理是连续地监测纯流动相和包含样品的流动相之间折射率的差值来测定试样的浓度，只要纯流动相与待测组分的折射率不同，检测器就会给出检测信号，其响应信号的大小与样品含量呈正比。按结构、原理不同可分为偏转型和反射型两种。
优点是通用常性强，只要折射率与流动相不同的物质都可检测，不破坏样品，操作简便，线性范围宽；它的缺点是灵敏度较低，不适宜于痕量分析，折射率随温度变化，不能用于梯度淋洗。
c、荧光检测器
荧光检测器是选择性检测器。作用原理是:具有特殊结构的化合物受紫外光激发后，发射出比吸收的紫外光波长较长的光，即荧光，荧光强度与物质的浓度呈线性关系。
荧光检测器特别适合于芳香族化合物、生化物质的检测，如有机胺类、氨基酸、维生素、激素、甾族化合物、酶等。
优点是灵敏度极高，比紫外吸收检测器高10～1000倍，特别适合于痕量分析；线性范围较宽，但比紫外吸收检测器窄；受外界条件影响小，可用于梯度淋洗。缺点是由于是选择性检测器，应用范围受到限制；样品浓度较高时，荧光强度与浓度不再呈线性关系；对影响荧光测量的一些干扰（如背景荧光等）非常敏感。

三、高效液相色谱法的类型及应用
根据分离机理的不同，高效液相色谱法分五类：液固吸附色谱法、液液分配色谱法、化学键合相色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法。
1、高效液相色谱法的固定相和流动相
A、固定相
高效液相色谱法所用的固定相按所承受的压力可分为硬胶、半硬胶或软胶三种。在前三种色谱类型中使用硬胶固定相，离子交换色谱中常常使用半硬胶，而在凝胶色谱中，硬胶、半硬胶和软胶固定相都可使用。
固定相按孔隙深度又可分为表面多孔和全多孔型。
表面多孔型的基体是球形玻璃珠，在玻璃表面涂敷一层多孔活性物质一如硅胶、氧化铝、离子交换树脂、分子筛等，也可以制成化学键合固定相，这种固定相的多孔层薄、孔浅、传质速度快，适合于快速分离，填充均匀紧密，机械强度高，能承受高压，适合于较简单的样品及常规分析。
全多孔型固定相比表面积大，柱容量大；小颗粒全多孔型固定相孔洞浅，传质速度仍很快，柱效高，分离效果好，适合于复杂样品、痕量组分的分离分析，这类固定相应用最广泛的。
B、流动相
在高效液相色谱中，当柱子和待测样品给定以后，选择什么样的溶剂作流动相，直接影响组分的分离度。通常需考虑作流动相的溶剂的物理性质（如沸点、紫外吸收等）和溶剂强度以及溶剂的种类和配比。因此，对作流动相的溶剂有如下要求。
（1）对待测样品有足够的溶解能力。
（2）与检测器要匹配 需考虑溶剂的物理性质对检测结果的影响。例如使用紫外可见吸收检测器时，所使用溶剂的截止波长必须小于检测波长；若使用折光检测器时，应选择与试样折射率相差较大的溶剂。
（3）纯度要高 通常采用分析纯溶剂，必要时可采用蒸馏等预处理方法进行进一步纯化，所用溶剂还应不与样品、固定相发生反应，本身不发生聚合、变质。
（4）粘度要低 溶剂粘度低，有利于分离。若溶剂粘度高，传质速度缓慢，柱效下降；粘度太低的溶剂沸点低、易挥发，在色谱过程中易产生气泡。通常选择沸点比分析温度高20～50℃的溶剂。
（5）在使用前需脱气 由于柱前和柱后压力相差较大，溶解在溶剂中的气体将以气泡形式逸出，干扰高压泵和检测器正常工作，因此常采用加热回流法、抽真空脱气法、超声波处理法等对溶剂进行预先脱气处理。
2、液固吸附色谱法
A、分离原理
液固吸附色谱基于固体吸附剂表面对不同物质吸附能力不同使混合物分离的。
当流动相经过色谱柱时，吸附剂表面的活性中心就要吸附溶剂分子，而当流动相携带着样品进入柱子时，样品分子就要取代吸附剂表面上的溶剂分子，从而在吸附剂表面上发生了竞争吸附——即样品分子与溶剂分子的竞争，样品中带有不同官能团的各种组分分子的竞争。各组分分子对吸附剂表面活性中心的竞争能力的大小，决定了它们的保留情况，被吸附剂吸附得越牢的组分，越不易被流动相洗脱下来，保留时间越长，反之，保留时间短，从而使混合物中各组分得到分离。
B、固定相
液固色谱法所用的固定相有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，目前液固色谱常使用硅胶，极性样品分子和碱性物质优先保留，后出峰。
C、流动相
流动相主要是非极性的烃类（如己烷、庚烷），并在其中加入少量的极性溶剂作为缓和剂（如水、二氯甲烷、甲醇等），极性越大的组分保留时间越长。选择液固色谱流动相时可参照溶剂强参数ε°（可从手册中查得），ε°越大，溶质的吸附越弱，溶剂的洗脱越强。
D、应用
液固吸附色谱选择性好，最大允许样品量较大，在分离几何异构体、族分离和制备色谱等方面具有独特的意义，还可用于分离偶氮染料、维生素、甾族化合物、多核芳烃、脂肪、油类、极性较小的植物色素等。
3、液液分配色谱法
A、分离原理
液液分配色谱法的固定相和流动相都是液体。当带有待测试样的流动相进入色谱柱时，溶质分子溶解到两种液相中（流动相与涂在载体上的固定液相互共存但互不相溶），并很快达到分配平衡，由于试样中各种组分在二液相中分配系数的不同而达到分离。
固定相是极性的、流动相是非极性的液液分配色谱称为正相分配色谱，它适于分离极性化合物，由于分子的作用力主要是静电力，所以正相分配色谱的分离顺序是非极性、弱极性、强极性；流动相的极性增加，洗脱能力增强。
固定相是非极性的、流动相是极性的液液分配色谱称为反相分配色谱，它适于分离极性较弱的化合物，分离顺序是极性较强的组分先出峰；流动相极性减弱，洗脱能力增强。
B、固定相
液液分配色谱所用的固定相是把固定液涂在很细的载体上。常用的固定液只有几种极性不同的物质，如β，β′一氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷和异三十烷等。
C、流动相
为使流出组分的在1～10之间，应选择合适的溶剂强度，即溶剂的极性、pH值、离子强度等，一般根据经验、参考文献、实验来进行选择。为了避免固定液溶解于流动相中而流失，选择的流动相与固定相的极性总是相反的，若用极性较强的或亲水性物质为固定相，应以极性较弱的或亲脂性溶剂为流动相；若用非极性或亲脂性物质为固定相，则应以极性较大的亲水性溶剂为流动相。
为了获得合适的溶剂强度，常采用两种或两种以上的溶剂作流动相。

D、应用
液液分配色谱法适用的样品类型广，最适合同系物组分的分离，例如它能分离水解蛋白质所生成的各种氨基酸，分离脂肪酸同系物等。由于涂敷在载体上的固定液易流失，重现性差，且不适合于梯度淋洗和采用高速流动相。
4、化学键合相色谱法
A、化学键合相色谱
化学键合相色谱是采用化学键合固定相的色谱技术。利用化学反应将固定液键合到载体表面上。化学键合相色谱在高效液相色谱的整个应用中占80%以上。
键合固定相的载体主要是表面多孔型或全多孔型硅胶，根据在硅胶表面（具有≡Si—OH基团）的化学反应不同，可制成四种键型的键合相：硅酸酯型硅胶与醇类发生酯化反应），硅碳型（硅胶与卤代烷反应），硅氮型(硅胶与胺类反应)，硅氧烷型(硅胶与有机硅烷反应)。
与液液分配色谱相比，化学键合相色谱具有以下优点：①化学键合固定相非常稳定，固定液不易流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；②适宜于梯度淋洗；③由于载体表面上可键合不同极性的官能团，可据样品情况进行选择。
化学键合相色谱可分为正相和反相键合相色谱。
B、反相（非极性）键合相色谱
反相键合相色谱采用非极性固定相。非极性固定相主要是各种烃基硅烷键合相和苯基键合相，键合的基团可以是C2、C4、C6、C8、C16、C18、C22烷基和苯基等。短链烷基键合相适合于极性样品分析，长链烷基键合相适合分离非极性化合物。
用的流动相为极性溶剂，以水为底溶剂，再加入与水能互溶的有机溶剂。最常用的流动相系统是甲醇-水、乙腈-水和四氢呋喃-水。
反相键合相色谱采用以水为底溶剂的流动相价廉、易得，流动相的紫外截止波长降低（水195nm，甲醇205nm，乙腈190nm），本底吸收少，有利于痕量组分的测定；更换溶剂和梯度淋洗方便；适合于极性较小的样品的分离，特别同系物、苯并系物等化合物的分离，可以用于药物、激素、天然产物、农药等复杂化合物的分离分析。
C、正相（极性）键合相色谱
正相键合相色谱采用极性固定相、非极性或弱极性流动相，适合于中等极性样品的分离。最常用的是含氨基、氰基、二醇基等极性基团的键合相。氨基键合组的—NH2呈碱性，并具有较强的氢键结合能力，可用于分离羧酸、酚、核苷酸、糖、氨基酸、甾体等物质；氰基键合相可很好的分离双键异构体或环状化合物。
所用流动相一般为烃类溶剂（如己烷、庚烷）和少量的极性溶剂（称为缓冲液），在极性键合相柱上，也可用极性水溶液作流动相，如乙腈一水作流动相。
5、离子交换色谱法
离子交换色谱的固定相是离子交换树脂，流动相是水溶液。它是利用待测样品中各组分离子与离子交换树脂的亲和力的不同而进行分离的。离子交树脂交换机理如下：
阴离子交换树脂 R+Y－+X－ Y－+ R+X－
阳离子交换树脂 R－Y+ + X+ Y+ +R－X+
X为待分离的组分离子，Y为流动相离子，R为离子交换树脂上带离子的部分，组分离子X－（X+）与流动相离子Y－（Y+）争夺离子交换树脂上的R+（R－）离子。组分离子对树脂的亲和力越大，即交换能力越大，越易被交换到树脂上，保留时间就越长；反之，亲和力小的组分离子保留时间就短。
离子交换树脂通常以聚苯乙烯和二烯基苯共聚物为基质带有各种活性离子交换基团的树脂，可分为阳离子和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂交换的是阳离子，活性基团是酸性基团，又分为强酸性和弱酸性阳离子交换树脂，若—SO3H为活性基团，酸性较强，磺酸型交换树脂为强酸性阳离子交换树脂，若—COOH为活性基团，则为弱酸性阳离子交换树脂。阴离子交换树脂交换的是阴离子，活性基团为碱性基团，可分为强碱性和弱碱性阴离子交换树脂，交换基团分别为强碱性的—N(CH3)3 Cl与弱碱性的—NH2（或—NHCH3、—N(CH3)2）。常用的是强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂。
离子交换色谱一般采用水的缓冲液作流动相，可通过改变流动相的pH值、缓冲液的类型（提供用以平衡的反离子）、离子强度以及加入少量有机溶剂、配位剂等方式来改变交换剂的选择性，使待测样品达到良好分离。
离子交换色谱广泛用于无机物的分离分析，例如碱金属、碱土金属、稀土金属等金属离子混合物的分离，性质十分相近的镧系和锕系元素的分离；用于食品中添加剂及污染物的分析；用于生物大分子的分离，例如氨基酸、蛋白质、糖类、核糖核酸、药物等样品的分离。
6、凝胶色谱法
凝胶色谱的固定相为多孔性凝胶类物质，流动相为水溶液或有机溶剂，它是根据不同组分分子体积的大小进行分离的。当样品由流动相携带经过柱子时，小体积分子可以渗透到孔的内部，最后从柱中流出；大体积分子不能扩大散到孔的内部，最先从柱中流出；中等体积分子介于二者之间流出。
所用固定相按交联度和含水量的不同分为软胶、半硬胶和硬胶三种。软质凝胶（如葡萄糖凝胶）适用于以水为流动相，交联度小的隙大，吸水膨胀度大，适用于分离相对分子质量大的物质，反之适用于分离相对分子质量小的物质，它不能承受压力；半硬胶（如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶）适用于有机溶剂为流动相，小孔胶用于分离较小分子，相对分子质量可达1000，大孔胶分离大分子，这种胶容量较大，渗透性较好，耐高压；硬胶（如多孔硅胶等）可供选择的流动相种类多，水或非水溶剂均可，改变流动相时，能迅速达到平衡，pH值、流速、离子强度等因素影响较小。
在凝胶色谱法中对流动相的要求不是为了控制分离，而是要求其粘度低，对样品的溶解性好，常用的流动相是四氢呋喃、苯、氯仿、水等。
凝胶色谱法广泛用来测定高聚物的相对分子质量分布和各种平均相对分子质量，可对未知物进行初步探索分离。例如对蛋白质、核酸、油脂、油类、添加剂等样品进行分离分析。但此方法要求样品中不同组分的相对分子质量必须有较大的差别。

作业：
1、《现代仪器分析》1998版，P81：1、4、7
2、《现代仪器分析》2002版，P261：1、4、6
3、《新编仪器分析》2009版，P251：1、2、4、10

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