基于形态特征和分子数据对微行彩轴甲的比较鉴定.pdf

DOI：10.13876/J.cnki.ydnse.230029第 42 卷 第 3 期2023 年 9 月延安大学学报（自然科学版）Journal of Yanan University（Natural Science Edition)Vol.42 No.3Sep.2023基于形态特征和分子数据对微行彩轴甲的比较鉴定高晟1，苑彩霞1，2*，徐德亮1，2（1.延安大学 生命科学学院；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西 延安 716000）摘要：为评估微行彩轴甲Falsocamaria microdera的形态学分种依据，同时为分支可靠性评估参数在小数据集多基因联合分析中的应用提供参考。基于形态特征和分子数据（COI；Cytb；16S rDNA）使用多个系统发育分析软件进行多基因联合分析。结果表明，形态学特征和分子数据均支持微行彩轴甲不同鞘翅颜色个体属于同一个种，其中鞘翅靛蓝色个体与黑色个体在种内亲缘关系上最近。另外，相较于单基因系统发育分析，多基因联合数据分析更具优势，其基因一致性因子（gCF）和位点一致性因子（sCF）的分支可靠性评估结果未出现异常。微行彩轴甲形态学分种依据成立，位点一致性因子可以在拓扑结构简单的小数据集多基因分析中使用。关键词：微行彩轴甲；分类；系统发育；多基因联合分析中图分类号：Q969.498.2 文献标识码：A 文章编号：1004-602X（2023）03-0040-07微行彩轴甲 Falsocamaria microdera Fairmaire，1899隶属于鞘翅目Coleoptera、拟步甲科Tenebrionidae、树甲亚科 Stenochiinae、轴甲族 Cnodalonini、彩轴甲属。该属目前已记载 11种，全部分布于东洋区，微行彩轴甲以体被强烈光泽、鞘翅具细刻点行以及间区扁平等特征区别于同属其他物种1-2。该种鞘翅颜色绚丽，作为观赏昆虫具有较高的观赏和收藏价值。由于该种个体间鞘翅颜色为单一蓝绿色、蓝紫色或近黑色，其体色差异显著，导致种类鉴定比较困难，且无相应的分子数据来支持他们是否为同一种，缺乏系统发育研究解析该种不同个体间的亲缘关系。因此，本研究基于分子数据与形态学鉴定结果，综合分析微行彩轴甲不同个体间的分种依据。多基因联合序列相较于单基因序列，可以得到更全面的结果。近年来，多基因联合分析广泛应用在昆虫研究中3-5。早期研究表明，建树序列内差异位点数达20，其拓扑结构中依旧可以产生100%的自举（Bootstrap）支持6。一致性因子（concordance factor，CF）的加入可以改变这种干扰，即基因一致性因子（gene concordance factor，gCF）和位点一致性因子（site concordance factor，sCF），二者通过统计决定性基因树占比及支持树分支决定性比对位点占比，来评估联合建树的可靠性7。一致性因子原算法极大程度受非同源特征（homoplasy）与远亲类群的影响，而基于 IQ-TREE 软件利用最大似然法（ML）的算法能够大幅降低这些影响8。而且最新研究表明，位点一致性因子可能并不适合评估分支可靠性，特别是在具有异构分支长度关系的情况下，位点一致性计算值可能会产生误导9。本研究尝试应用新算法与一致性因子评估联合建树的可靠性，为该参数在小数据集多基因联合分析中的应用提供参考。同时，通过形态学鉴定结果验证多基因联合分析法的合理性与优势。本研究通过多个系统发育分析软件进行多基因数据联合分析，深化对中国彩轴甲属基因多样性的认识，丰富该类群物种分子特征信息数据库。同时，基于形态特征和分子数据对微行彩轴甲分种依收稿日期：2023-04-02基金项目：国家自然科学基金项目（31960113）作者简介：高晟（1997），男，浙江绍兴人，延安大学硕士研究生。*通信作者第 3 期高晟 等：基于形态特征和分子数据对微行彩轴甲的比较鉴定据进行佐证，构建更科学自然的系统发育树，以期促进中国彩轴甲属分类研究的新发展。1材料与方法1.1供试虫源微行彩轴甲样本采自广西来宾市金秀县大瑶山和长桐乡，采集标本用无水乙醇浸泡，编号后带回实验室保存于-20 冰箱。4类样本的鞘翅颜色分别为黑色（black）、绿色（green）、淡紫红色（light amaranth）、靛蓝色（indigo）。属内对照为赤纹彩轴甲F.spectabilis（Pascoe，1860）。1.2总DNA提取、PCR扩增和测序挑选试验虫体一侧中足或后足用于DNA提取，其余虫体留作形态结构鉴定。采用昆虫DNA提取试剂盒（Omega Bio-tek，USA）进行基因组总 DNA提取。PCR引物由上海生工生物技术公司合成（表1）。PCR反应体系25 L：模板DNA 2 L，2Taq Master Mix 12.5 L，上游引物1 L，下游引物1 L，无菌水8.5 L。EX-Taq PCR扩增条件：94 预变性240 s；94 变性45 s；50 退火90 s；72 延伸60 s，反应35个循环；72 最终延伸480 s。PCR扩增产物使用浓度为1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将样本送往上海生工生物技术有限公司西安分公司进行双向测序。1.3系统发育分析1.3.1外群选择本研究共测定15条序列，NCBI中收集的滇中窄亮轴甲Morphostenophanes yunnanu和弯胫大轴甲Promethis valgipes valgipes为外群序列。所测标本序列均已上传至NCBI并获得基因登录号，相关样本及外群信息见表2。表1PCR引物序列信息基因COICytb16S rDNA引物F 2183R 3014F revcb2jhR rebcbjF 133998R 12887基因序列(5-3)CAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCCAATGCACTAATCTGCCATATTATGAGGACAAATATCATTTTGAGGWTCAGGTCGAGCTCCAATTCATGTCGCCTGTTTATCAAAAACATCCGGTCTGAACTCAGATCAT文献101110表2样本及下载物种序列登录号采集地点和时间大瑶山2022-06-25长垌乡2021-05-01样本微行彩轴甲（鞘翅黑色）F.microdera Fairmaire,1899微行彩轴甲（鞘翅绿色）F.microdera Fairmaire,1899微行彩轴甲（鞘翅淡紫红色）F.microdera Fairmaire,1899微行彩轴甲（鞘翅靛蓝色）F.microdera Fairmaire,1899赤纹彩轴甲F.spectabilis Pascoe,1860滇中窄亮轴甲Morphostenophanes yunnanus Zhou,2020弯胫大轴甲Promethis valgipes valgipes Marseul,1876基因COICytb16S rDNACOICytb16S rDNACOICytb16S rDNACOICytb16S rDNACOICytb16S rDNAmitogenomemitogenome物种序列登录号OQ843899OQ857151OQ859147OQ843900OQ857152OQ859148OQ843901OQ857153OQ859149OQ843902OQ857154OQ859150OQ843903OQ857155OQ859151MW822745.1NC_054362.141延安大学学报（自然科学版）第 42 卷 1.3.2多重序列比对及数据分析使用 PhyloSuite v1.2.3软件12将各基因片段序列进行MAFFT比对分析，以便后续将3个基因片段串联进行多基因联合建树。将比对结果导入MEGA 11.0.13 软 件，统 计 碱 基 组 成 情 况、转 换（Transition，TS）与颠换（Transversion，TV）比值等，计算遗传距离选用Kimura 2-parameter模型。使用DAMBE v7.0.28 软件进行碱基替代饱和度检验（Substitution Saturation）。使用IQTREE v.2.2.2进行似然映射分析（Likelihood mapping analysis）。1.3.3系统发育树的构建本 研 究 构 建 的 系 统 发 育 树 均 基 于 BIC（Bayesian information criterion）标准的最佳模型。最大似然法构建系统发育树，Bootstrap 分析选用Ultrafast 与 SH-aLRT；BI 分析使用 MrBayes 进行分析并计算后验概率。多基因联合分析前，通过“PartitionFinder 2”选择最佳分区方案，完成基因串联。同质性检验（Partition homogeneity test）可以验证串联结果是否适合联合13-14。构建的系统发育树在FigTree与iTOL在线软件上进行美化调整。1.4形态学鉴定将酒精浸泡标本放入温水中复软，完成整姿。雄性样本剥离生殖器，装入含甘油的小离心管中保存。使用Leica M205 A体视显微镜观察，据已有资料分类鉴定，拍摄标本特征照，验证分子分析结果。2结果与分析2.1序列组成与遗传距离分析分别对COI、Cytb、16S rDNA 3个基因片段及联合基因序列组成成分进行统计（表3）。联合基因序列总长度为1 541 bp。单基因序列碱基中的A+T含量分别为66.4%、68.6%和69.1%，表现出明显的AT含量偏向性，与昆虫线粒体碱基构成特征相符15。数据集 R 值分别为 1.2、1.2、0.9 和 1.1。其中，COI、Cytb 及联合基因转换率大于颠换率，选用Kimura 2-parameter模型计算遗传距离。但也有研究在转换率略低于颠换值（R=0.9）时，用Kimura 2-parameter模型计算遗传距离16。基于Kimura 2-parameter模型，分别计算7个样本种内及种间遗传距离（表4）。微行彩轴甲种内距离在 00.030 之间，平均值分别为 0.017、0.024、0.003和0.015。种内关系中，鞘翅靛蓝色与黑色个体间遗传距离最近，亲缘关系最为接近。种间遗传距离在 0.1270.398 之间，平均值分别为 0.232、0.279、0.194和0.235，种间距离显著大于种内距离。在种间关系中，微行彩轴甲与赤纹彩轴甲遗传距离最近，符合二者同属异种的亲缘关系。属间关系上，彩轴甲属与大轴甲属Promethis的亲缘关系较窄亮轴甲属Morphostenophanes更为接近。2.2序列饱和性分析COI、Cytb、16S rDNA单基因片段及联合基因替代饱和度检验结果中，Iss值均小于Iss.c值，且差异显著（P0.05），串联的基因间无显著性差异，说明这些基因的进化历史相同，可以用来构建联合基因系统发育树。2.5系统发育树结果单基因构建ML过程中，COI和Cytb基因片段选用TIM2+F+G4模型，16S rDNA基因片段选用HKY+F+G4模型；单基因构建BI树过程中，COI和Cytb基因片段选用GTR+F+G4模型，16S rDNA基因片段选用 HKY+F+G4 模 型。单 基 因 构 建 的 ML 树 中，Ultrafast bootstrap95%且 SH-aLRT70%时具有分表3COI、Cytb、16S rDNA及联合基因序列组成统计表基因COICytb16S rDNAMultigene总长度/bp6544774101 541si524423119sv423727106R1.21.20.91.1A+T含量/%66.468.669.167.8G+C含量/%33.631.430.932.2注：si为转换位点数;sv为变异位点数;R=si/sv42第 3 期高晟 等：基于形态特征和分子数据对微行彩轴甲的比较鉴定支可靠性17，种间关系均满足分支可靠性；构建的BI树结果中，后验概率（pp values）0.95时，具分支可靠性18，故除种间关系分析外，仅COI基因片段的种内关系可靠。联合基因构建ML和BI树的过程中，16S rDNA分区最适合 HKY+G 模型，Cytb+COI 分区最适合GTR+G 模型。使用 IQTREE v2.2.2 进行拓扑结构的比较，得到P值均大于0.05，建树结果可被接受。利用不同系统发育重建方法（ML/BI/NJ）进行多基因联合分析，得到了相同的拓扑结构（图2）。其中，在最大似然法构建系统发育树时，一致性因子（gCF/sCF）均大于50%时，说明分支可靠性高7。另外，邻接法建树的自展值大于95，贝叶斯建树的后验概率大于0.95，认为其建树结果均可靠。外群中滇中窄亮轴甲和弯胫大轴甲聚成一支，位于系统发育树根部。内群中，赤纹彩轴甲与微行彩轴甲聚为一支，微行彩轴甲的4类样本与同属的赤纹彩轴甲种间差异显著。微行彩轴甲 4类样本中，鞘翅黑色与靛蓝色个体的亲缘关系最为接近。表4基于Kimura 2-parameter模型的种内和种间遗传距离基因COICytb16S rDNAMultigene序号1234567123456712345671234567种名F.microdera(black)F.microdera(green)F.microdera(light amaranth)F.microdera(indigo)F.spectabilisM.yunnanusP.valgipes valgipesF.microdera(black)F.microdera(green)F.microdera(light amaranth)F.microdera(indigo)F.spectabilisM.yunnanusP.valgipes valgipesF.microdera(black)F.microdera(green)F.microdera(light amaranth)F.microdera(indigo)F.spectabilisM.yunnanusP.valgipes valgipesF.microdera(black)F.microdera(green)F.microdera(light amaranth)F.microdera(indigo)F.spectabilisM.yunnanusP.valgipes valgipes10.0250.01100.1470.2990.2340.0300.02600.1750.3980.2520.005000.1240.2680.1760.0210.01200.1490.3190.22320.0270.0250.1530.2750.2300.0300.0300.1720.3940.2450.0050.0050.1220.2680.1760.0220.0210.1500.3070.22030.0110.1530.2990.2320.0260.1670.3860.23900.1240.2680.1760.0120.1490.3160.21940.1470.2990.2340.1750.3980.2520.1240.2680.1760.1490.3190.22350.2950.2560.3950.2600.2740.1820.3180.23660.2260.2840.1820.2317图1各基因似然映射分析43延安大学学报（自然科学版）第 42 卷 2.6形态学特征体型大，靛蓝色、绿色、淡紫红色或近于黑色，各类体长差异不明显。前胸背板两侧由中部向端部逐渐变窄，后角之前较强烈收缩；前缘饰边弱，基部弱二弯并具有清晰饰边，侧缘饰边完整；背面具稀疏细小刻点；前角钝，后角近直角。鞘翅基部1/2两侧近平行，刻点行细而清晰。雄性外生殖器侧面观弧形，基片形态相似，向端部逐渐变窄，端叶与总长之比在58.11%61.11%之间，靛蓝色个体的端叶长度所占比例最小。形态学特征及测量数据见图3和表5。综合雄性外部形态特征与外生殖器特征，可以判断不同鞘翅颜色的个体应为微行彩轴甲。3讨论3.1所选线粒体基因用于物种鉴定的有效性昆虫的线粒体基因组包含独立的遗传物质，参与细胞信息传递，与细胞内的能量供应相关，并且具有结构简单和相对保守的基因组组织结构等特点。近年来，昆虫线粒体基因组及基因片段越来越多地应用于昆虫系统学研究19-21。线粒体基因相对于核基因来说，具有更快的进化速率，可以更好地实现低级阶元的鉴定。作为典型的母系遗传基因，COI的基因重组率更低，相对于其他线粒体基因（如16S rDNA）具有更少的插入和缺失现象，分子进化形式以点突变为主，同时具有一定的保守性来实现较为稳定的扩增22，利于区分属以下的分类单元。16S rDNA基因的间隔区IGS区中包含ETS和NTS，这一区域中的基因变异速率很高，适用于种、种群等以下水平的分类研究工作23。Cytb基因进化速度适中，较短的一个片段就能反映出种乃至科级阶元的系统发育信息。其不仅具有与COI相同的序列变异和A/T偏倚水平11，且在不同昆虫中存在很高的同一性与同源性特征24。3.2多基因联合有效性在序列组成成分分析中发现多基因联合数据集R值小于2，说明这些序列转换与颠换未达到饱和，适于构建系统发育树基因可靠度高25，该结果与替代饱和性散点图分析结果一致。联合基因组序列发育信号完全解析部分达到了100%，无系统表5微行彩轴甲4类样本形态学数据鞘翅颜色黑色绿色淡紫红色靛蓝色雄虫体长/cm3.153.113.193.09外生殖器测量值宽/mm1.021.081.171.04端叶长/mm2.713.093.052.87总长/mm4.575.065.104.94端叶长/总长/%59.3361.1159.7758.11图3微行彩轴甲4类样本雄性外生殖器和整体图（比例尺：1 mm）图2基于多基因联合数据构建的系统发育树（ML/BI/NJ）44第 3 期高晟 等：基于形态特征和分子数据对微行彩轴甲的比较鉴定发育信号干扰。系统发育树结果与遗传距离分析结果一致，但系统发育树可以更清晰地展示亲缘关系。通过不同方法（ML/BI/NJ）构建的多基因联合系统发育树，呈现出相同的拓扑结构；在各项检测指标及建树分支可靠性上，多基因联合分析都较单基因分析更有优势。有研究表明，在不同基因串联时，确定各分区子集的枝长类型可以显著提高建树结果的支持度26。在 Partition Finder 2 的枝长类型中，含关联（Linked）/部分关联（Partially linked）/完全不关联（Unlinked），本研究选择串联的 3个基因片段均源于线粒体基因组，进化速率相同，故枝长类型选择为关联。联合基因同质性检验结果（P=1）亦证明它们进化速率相同。多基因联合构建系统发育树需要经过建树可靠性评估验证，保证其具有更高的科学性。多基因联合的最大似然树结果中，gCF和sCF均大于50，表示联合建树的分支可靠性高。本研究中数据集所含分支决定性比对位点少、拓扑分支结构简单（仅有1个内群种间对照），故可以作为多基因联合建树分支可靠性的评估对象。然而，gCF的阈值范围过低，只有在接近0%时才需要注意有效基因支持率；sCF的阈值在33%附近，但该值在异构分支长度测试中已被视为不可靠评估值9。所以在大数据集构建复杂拓扑结构的情况时，需要慎重考虑与应用。4结论本研究基于分子数据和形态学特征结果验证了微行彩轴甲不同鞘翅颜色差异显著的4类个体为同一物种，同时，丰富了该类群分子特征数据库。相较于单个基因分析，多基因联合不管在拓扑结构、系统发育信号检测还是分支可靠性上都更具优势。对于一些种、属分化量较少的类群，为其通过多基因联合重建系统发育关系提供了参考，sCF可以在此类拓扑结构简单的小数据集多基因分析中使用。提供最新的软件操作与可靠性评估验证来支持多基因联合分析，以期构建更自然可信度更高的系统发育树。参考文献：1 MASUMOTO K.Tenebrionidae of East Asia（）on the genus Falsocamaria Pic（Cnodalonini）J.Elytra，1990，18（1）：93-100.2 WANG L F，REN G D，LIU C.Review 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species，the elytra indigo individual was the closest to the elytra black individual in terms of intraspecific kinship.In addition，compared with single-gene phylogenetic analysis，multigene phylogenetic analysis has more advantages，and the branching reliability evaluation results of the site-concordance factor（sCF）and gene-concordance factor（gCF）were normal.It is concluded that the morphological basis for classifying species of Falsocamaria microdera is established，and the site-concordance factor（sCF）can be used in the multigene phylogenetic analysis in small datasets with simple topological structure.Key words：Falsocamaria microdera；classification；phylogeny；multigene phylogenetic analysis46