细胞化学染色课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞化学染色检验,申家辉,1,1,一、概述,二、细胞化学染色的基本方法,三、临床应用,2,2,1、概念：,细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门科学，以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质（包括,酶类、脂类、蛋白质、糖类、铁、核酸等,）作定性、定位、半定量分析的方法。,3,一、概 述,3,2.细胞化学染色的目的,（1）辅助判断急性白血病的类型,（2）辅助血液系统等疾病的诊断与鉴别诊断,4,3.,细胞化学染色的基本步骤：,包括固定、显色反应、复染。,（1）固定：为了保持细胞结构及化学成分的稳定性而选用的方法。根据染色的目的，最常用的固定剂有,甲醛、甲醇、乙醇,等。,5,5,（2）显色：,通过不同的化学反应，最终形成稳定的有色沉淀，使被监测的化学物质显示出来。包括,偶氮偶联法：如NAP、ACP及各种脂酶染色,普鲁氏蓝反应：如铁染色,雪夫（shiff）反应：如PAS染色,联苯胺法：如POX染色,（3）复染：,使各种,目的细胞,能显示出来更便于观察,6,6,过氧化物酶染色,中性粒细胞碱性磷酸酶染色糖 原 染 色,非特异性酯酶染色,特异性酯酶染色,骨髓铁染色,7,二、细胞化学染色的基本方法,7,1、,原理：,pox,H,2,O,2,O,联苯胺,联苯胺蓝,+,亚硝基铁氰化钠,8,蓝黑色颗粒,（一)过氧化物酶,(POX),染色,8,2.试剂,(1)联苯胺,酒精,溶液：,取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠,饱合液（36%）,1ml,再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。,(2)稀过氧化氢（,新鲜配制,）：取50ml蒸馏水加30%H,2,O,2,1滴。,（3）,瑞吉氏复染液,9,9,3、染色方法,1、新鲜干燥涂片加联苯胺酒精溶液10滴，覆盖整个髓膜，,固定,1-2min。,2、再加等量的稀H,2,O,2,，混匀后,染色,45min,勿倒去染液直接流水冲洗。,3、瑞氏染液复染。,10,10,4、注意事项,（1）H,2,O,2,要新鲜配制，注意有效性,（2）标本要新鲜，最长不超过一周，时间长了酶活性减弱。,（3）POX染色后，一定要冲洗干净，否则染料堆积或浮于表面，影响瑞氏染色结果观察。,11,11,5、结果判定：,中性粒细胞杆状及分叶核呈强阳性是染色成功的标志(设对照片）。,在细胞的胞浆中出现蓝绿色或蓝棕色颗粒为阳性反应。,12,12,1.,中性成熟粒细胞，呈强阳性；,2.,晚幼红细胞，呈阴性；,3.,单核细胞，呈弱阳性；,4.,浆细胞，呈阴性,13,14,14,急性粒细胞白血病（,M,2a,),的,POX,染色,原始粒细胞均呈阳性,15,急性淋巴细胞白血病的,POX,染色,1.,中性成熟粒细胞，呈强阳性；其他原始淋巴细胞均呈阴性,16,急性早幼粒细胞白血病的,POX,染色,.,原始红细胞，呈阴性；其他早幼粒细胞均呈强阳性,17,急性单核细胞白血病的,POX,染色,1.,中性成熟粒细胞，呈强阳性；,2.,原始单核细胞，呈阳性；,3.,原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性,18,6、临床意义,（1）正常分布,粒系:,早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈不同程度阳性。,单核系:,早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性。,淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性,。,19,19,（2）急性白血病的鉴别诊断,幼稚,细胞POX阳性率3%：急非淋（AML),幼稚,细胞POX阳性率3%：急淋（ALL),20,20,（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色 （偶氮偶联法）,1.原理,磷酸奈酚钠 磷酸+萘酚,偶联,萘酚+重氮盐 不溶性有色沉淀物定位于胞浆,(坚固蓝RR盐),21,NAP,PH9.2,9.8,21,22,2.,试剂,（,1,）固定剂：,10,甲醛甲醇,溶液,（,2,）,Tris-Hcl,缓冲液的配制：,Tris,粉,三胺基甲烷,4.85,克溶于,200ml,蒸馏水中,加浓,HCL1-2,滴，,PH,调至,9.2,，,4,保存！,（,3,）作用(基质液),:,磷酸萘酚钠,5mg,N-N,二甲基酰胺,1ml,Tris-Hcl,液,4ml,坚固蓝,RR,盐,5mg,（,4,）复染液：,1%,中性红,22,3.操作步骤,1、新鲜、干燥的,外周血或骨髓涂片,（标本片及对照片）加固定剂作用30秒（染缸），水洗待干；,2、滴加作用液，,室温染色15min,，水洗待干；,3、1%中性红复染1min,23,23,4.注意事项,(1)重氮盐以坚固蓝RR盐为最佳；,(2)坚固蓝RR盐应适量：过多易造成染色失败，过少使反应减弱；,(3),每次都要做阳性对照,；,(4)作用液新鲜配制，配好后要立即使用,24,24,5.,结果观察:,(对照片成熟中性粒细胞中出现棕黑色颗粒为阳性细胞，说明染色成功),正常人除成熟中性粒细胞NAP可见阳性外，其它血细胞均为阴性。且,正常阳性率,40%,，积分值30130分。,25,25,6.NAP阳性结果及积分判断标准,“”0分，胞浆中无阳性颗粒,“+”1分，胞浆中含有少量颗粒,“2+”2分，胞浆中含有中等量颗粒,“3+”3分，胞浆中含有丰富的颗粒，但胞核清楚,“4+”4分，胞浆中含有丰富粗大的颗粒，但胞核不清楚,26,中性粒细胞碱性磷酸酶染色,1.,中性成熟粒细胞（,+,）；,2.,中性成熟粒细胞（,+,）；,3.,中性成熟粒细胞（,+,）；,4.,中性成熟粒细胞（,+,）；,5.,淋巴细胞（,-,）,27,28,28,29,NAP分级29,7.临床意义,增高：,细菌感染、类白、AA、急淋、慢粒急变、骨髓增殖性疾病，恶性淋巴瘤。,降低：,慢粒、急粒、PNH、MDS、恶组,30,30,8.,鉴别诊断,慢粒与类白：,前；后。,PNH与AA,：前；后。,急粒与急淋,：前；后。,MDS,与慢性再障：前；后。,病毒感染与细菌感染：前者无明显变化，后者。,恶组与反应性组织细胞增多：前；后。,31,31,（三）酯酶染色,概述,特异性酯酶染色,非特异性酯酶染色,32,概 述,根据各类细胞所含酯酶特异性高低分为特异性酯酶(SE)和非特异性酯酶(NSE)；特异性酯酶是指,氯乙酸AS-D萘酚酯酶（,NAS-D,CE）,；非特异性酯酶根据水解基质液的PH不同，又分为中性,NSE,（,-醋酸萘酚酯酶,），酸性,NSE,（,酸性-醋酸萘酚酯酶），碱性,NSE,（,-丁酸萘酚酯酶）。,目前常用的是,氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NAS-D,CE,和,-醋酸萘酚酯酶（,-NAE,）+,NaF抑制试验,。,33,1.,原理（偶氮偶联法）,氯乙酸ASD萘酚 ASD萘酚,+,重氮盐(坚固蓝B盐),34,NAS-D,CE,不溶性有色沉淀物定位于胞浆内酶所在位,特异性酯酶,(CE),染色,基质液,基质液,34,2,.试剂：,（1）固定液：,10甲醛甲醇,溶液,（2）作用液（基质液）,氯乙酸ASD萘酚 5mg,丙酮 5-8ml,磷酸盐缓冲液 19ml,坚固蓝B盐,10mg,（3）复染液：,1%中性红,35,35,3.染色方法,（1）固定：10%甲醛甲醇液固定30秒，水洗晾干,（2）滴加作用液,37孵育30min,，水洗,（3）1%中性红复染1min，水洗晾干镜检。,36,36,4.注意事项：,1.氯乙酸AS-D萘酚溶液应避光，4冰箱,保存,，,变黄或混浊即失效。,2.染色温度37效果最好,37,37,5.结果判断,中性分叶核粒细胞胞浆中见细小，,弥漫分布的蓝色颗粒为染色成功的标志。,6.临床意义,粒系除早期原粒外，其余阶段细胞均为阳性，其它各系均为阴性。CE染色对粒细胞白血病有特异性的诊断价值。,38,38,39,CE,39,非特异性酯酶染色（,NAE）,1.,原理：,-醋酸萘酚 -萘酚,重氮盐,40,-NAE,形成不溶性有色沉淀定位于胞浆内酶所在位置,7.47.6,(,坚固盐,B),40,2.试剂,（1）,固定液：甲醛,（2）作用液:,-醋酸萘酚 5mg,丙酮 5-8ml,磷酸盐缓冲液 10ml,固蓝B盐 10mg,（,3）复染液：10g/L甲基绿,水溶液,41,41,42,3.,染色步骤,（,1,）,甲醛蒸气固定,5-10min,，流水冲洗,5min,晾干,（,2,）放入作用液,37,1h,流水冲洗。,（,3,）,10g/L,的甲基绿溶液复染,5min,水洗待干镜检,（,4,）,NaF,抑制试验：在,40ml,作用液,中加,NaF,15mg,同样染色后,，油镜计数,100,个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的,阳性率和积分,，按公式计算出抑制率，,正常小于,50%,。,42,A,图：急性单核细胞白血病,-NAE,染色,原始、幼稚单核细胞多呈强阳性,B,图：急性单核细胞白血病,-NAE,氟化钠抑制染色,原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制,（与,A,图为同一标本）,A,B,43,4,.结果判断：,胞浆内有棕色或棕黑色沉淀物为阳性,染色成功指标：,正常部分原始、幼稚及成熟单核细胞呈阳性；部分粒细胞为弱阳性反应；部分成熟淋巴或个别中、晚幼红呈阳性。,44,44,45,45,5.临床意义：,鉴别急性白血病,（1）急单时，原始至成熟单核大多为,-,NAE阳性，且易被NaF抑制，,抑制率正常大于50%。,（2）急粒时，白血病细胞多呈阴性或弱阳性，M,3,呈阳性，但,均不被NaF抑制。,酯酶双染：,同一张血涂片上的细胞分别在两种不同的基质液中作用一定时间，复染镜检。主用于鉴别诊断AML-M,4,亚型,。,46,46,骨髓涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染色显示，原始粒细胞胞浆呈蓝色CE阳性反应；而原始单核细胞胞浆呈棕色的NAE阳性反应。,47,（,四,）糖 原 染 色(PAS),细胞内糖原中,的,乙二醇基,48,氧化,过碘酸,二醛基,1.,原理,（过碘酸,-,雪夫氏反应）,二醛基经过加成和缩合使,无色,亚硫酸,品红,恢复品红的红色,失去亚硫酸,定位于含有糖原的细胞内,48,2.试剂,（,1）10g/L的过碘酸,氧化剂,雪夫氏试剂（schiff）,：红色品红与偏重亚硫酸钠，变成了无色品红。,20/L甲基绿,复染液,49,49,3.操作,（,1）新鲜髓片放在,95乙醇,中固定10分钟；蒸馏水冲洗待干；,（2）10g/L过碘酸氧化15分钟；,蒸馏水,冲洗；,（3）置雪夫氏试剂浸泡45分钟，水洗后凉干；,（4）甲基绿复染15分钟，水洗待干镜检。,50,50,4.,注意事项,（,1）所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。,（2）,雪夫氏染液应避光密封保存，变红则,失效,。,（3）放入雪夫氏溶液之前，用蒸馏水洗涂片，,而且一定要完全干燥，若有水，试剂变色失效。,51,51,（4）染色时间和温度应相对恒定，一般,37,效果最,好。,（5）染好的标本不能久放，8天后渐退色，因此应及时观察。,52,52,5.结果观察,阳性：,细胞浆内的红色阳性物呈弥散状、颗粒状或块状，胞核染绿色。,阴性：胞浆无色或无红色颗粒。,53,53,6.临床意义,正常血细胞的染色反应,（1）粒系：原始细胞多为阴性，随着细胞成,熟，阳性逐渐增强。,（,2）淋系：,正常人阳性率10,-,50%之间，多为,20%以下。,（3）,红系：PAS呈阴性反应,（4）巨核：PAS呈阳性反应,（5）单核系:呈阴性或细颗粒状弱阳性。,54,54,正常血细胞,PAS,染色,1.,原始粒细胞（,-,）,2.,早幼粒细胞（,+,）,3.,中性中幼粒细胞（,+,）,4.,中性晚幼粒细胞（,+,）,5.,中性杆状核粒细胞（,+,）,6.,中性分叶核粒细胞（,+,）,7.,嗜碱性粒细胞（,+,）,8.,嗜酸性粒细胞（,+,）,9.,单核细胞（,）,10.,淋巴细胞（,+,）,55,疾病鉴别,（1）红细胞系统疾病：,M,6,、MDS呈阳性,（均匀或块状红色）,；巨幼贫、再障呈阴性。,（2）白血病：,急淋及慢淋：,粗颗粒或块状阳性,急粒：阴性或弱阳性（弥散细颗粒）,急单：阳性，多为细颗粒有时可见粗颗粒,急性巨核细胞白血病：,阳性（块状）,56,56,PAS,AML-M6,幼红细胞呈阳性反应,MA,幼红细胞呈阴性反应,57,急性淋巴细胞白血病,PAS,染色,原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性,58,59,急淋PAS阳性细胞,59,60,PAS阳性的幼红细胞,60,1.原理,(普鲁氏蓝反应),4Fe,3+,+K,4,Fe(CN),6,Fe,4,Fe(CN),6,3,+12K,+,(亚铁氰化,钾,)(蓝色亚铁氰化,铁,),61,（六）骨髓铁染色,稀盐酸,细胞外铁：主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中,细胞内铁：主要存在于有核红细胞中,61,2.试剂,（1）固定液：甲醇,（2）酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾5份，浓盐酸1份。取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓慢加入浓盐酸，边滴边摇由开始的白色沉淀消失为至。,（3）复染剂：0.5%沙黄,62,62,3.操作步骤,（1）选片做标记,，,甲醇固定10min,（2）,37,滴加酸性亚铁氰化钾溶液染色30min,（3）,蒸馏水,冲洗2min后沙黄复染1min，待干镜检,。,63,63,4.注意事项,（1）所用的玻片及器具必须清洁，无铁污染。,（2）应选有骨髓小粒的髓片做铁染色，以便观察细胞外铁。,（3）作用液必须新鲜配制。,（4）亚铁氰化钾暴露于空气中，易氧化变质，,贮于棕色瓶中，避光密封保存,。,64,64,（5）复染前应充分冲洗，否则铁粒状结晶过多，影响观察。,6）计数时要不停地旋转细螺旋器，因为铁粒在细胞内的高低度不一致，每看一个中、晚幼红细胞要旋转几次，直到看清为止。,（7）观察内铁时，幼红及淋巴细胞要分清，,幼红细胞核为鲜红色，淋巴细胞核为淡红色，,（8）,与污染铁的鉴别：,污染铁不在髓小粒和细胞内，而是浮在上边，而且蓝中带黑。,65,65,5.结果观察：,（1）,正常幼红细胞核呈鲜红、浆淡黄、铁颗粒呈蓝绿色,（2）低倍镜观察细胞外铁：涂片尾部和髓小粒附近,阴性：无蓝绿色铁粒。,阳性：含有不同程度的铁粒、铁小珠、铁小块。,根据阳性程度不同分四级。,66,66,67,细胞外铁,幼红细胞外的骨髓铁,(+),少量铁粒,偶见铁小珠,（2）,较多铁粒,较多铁小珠,(3+),许多铁粒,许多铁小珠,少量小块状,。,(4+),极多的铁颗粒,铁小珠,许多小块密集,成堆。,67,细胞外铁观察阳性为蓝绿色沉淀,68,（3）,细胞内铁：油镜计数100个中晚幼红细胞；并记,录含有蓝色颗粒的铁粒幼红细胞百分率。,型 胞浆内1-2个铁小粒,型 胞浆内3-5个铁小粒,型 胞浆内6-10个铁小粒或1-4粗大颗粒,型 含铁小粒10个以上或5个以上粗大颗粒,环形铁粒幼红细胞：,含铁粒在6粒以上，其中2/3以上铁粒围绕核排列，超过1/2周。,69,69,骨髓细胞内铁染色,1.,环形铁粒幼红细胞；,2.,铁粒幼红细胞,70,71,71,5.正常参考值,细胞外铁：+（2/3为+，1/3为+）,细胞内铁：20%40%（正常人型多见，少数为型）,72,72,7.临床意义：,(1),缺铁性贫血,:外铁或()，内铁 15%。,此方法是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种,辅助方 法,；经铁剂治疗后细胞内外铁迅速增多。,(2),铁粒幼细胞性贫血,：内铁阳性率高于40%，可达70%以上，铁粒数目增多，颗粒粗大，可见环铁；外铁多为+2，可达+3+4。,（3,）,MDS-RAS：,内铁阳性率，环铁15%。,73,73,（,4）感染性贫血：外铁，内铁,（5）地中海贫血：内铁，外铁,（6）,巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再障、白,血病：外铁、内铁正常或升高,。,74,74,三、临床应用,75,对于贫血病例铁染色应作为常规染色,外铁或(-)，内铁：,在缺铁性贫血。,内、外铁正常或增多：,巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血。,外铁增多，内铁减少：,感染性贫血、肝病性贫血、肾病性贫血。,内、外铁均增多：,增生异常综合症（MDS）、铁粒幼细胞性贫血。,76,一、在贫血诊断中的应用,76,在巨幼细胞性贫血和红血病或红白血病,，,作PAS染色,。,阵发性睡眠性血红蛋白尿骨髓增生减低者与再生,障碍性贫血，NAP染色,77,M6 PAS,染色阳性，而巨幼贫幼红细胞阴性,PNH,的,NAP,减低，而,AA,的,NAP,活性升高,77,首选化学染色为POX或苏丹黑B染色：,急淋病人POX阳性细胞3,急非淋POX或SB阳性细胞3,PAS反应进一步鉴别确认：,原淋细胞阳性物多为粗大颗粒或团块状,原粒细胞呈小颗粒或弥漫染色,78,二、在白血病诊断中的应用,78,急非淋病人：,M2、M3 POX呈强阳性，M1、M4、M5呈弱阳性。,酯酶染色为急非淋的进一步分型提供了可靠的客观指标：,CE为粒系标志酶，ANAE为单核系标志酶（NaF抑制实验）。,慢性粒细胞性白血病和类白血病反应鉴别的有效办法是,NAP,：慢粒时减低，类白时显著增高。,79,79,80,急性白血病,急淋,急非淋,L1,L2,L3,M1,M2,M3,M4,M5,M6,M7,Pox,PAS+NAP,CE,ANAE,染色,NAF80,81,PAS:,阳性，颗 粒状,NAP:,积分增高,PAS:,大小不 定块状阳性,NAP:,积分增高,L1,、,L2,、,L3,形态区分,M7,，可做免疫分型,ANAE+NaF抑制,M5,：阳性强阳性，抑制率,50,M4:,阳性，抑制率,50,（形态、做酯酶双染）,NAP:,积分减低,涂片可见较多幼稚细胞,POX,染色,阴性（阳性率,3%),阳性，强阳性,阴性或弱阳性,（部分阴性，部分阳性,）,PAS+NAP,M2、M3最强,M1、M5最弱,（CE阳性，形态区分）,NAP:积分减低,CE,81,基础理论,：造血器官、造血干细胞、造血微环境、造血调控,。,基本方法,：血细胞发育与成熟（规律）、正常血细胞形态学、骨髓细胞形态学检验、细胞化学染色,。,临床应用,：血液病诊断中的应用、血液病治疗监测中的应用,。,82,83,谢谢,83,