基于末端限制性片段长度多态性分析鸭肠道微生物群落结构.pdf

研究报道China Poultry ScienceVol.45 No.9 2023基于末端限制性片段长度多态性分析鸭肠道微生物群落结构杨为敏，韩登阁，孟玉学1*（1.汝州市中等专业学校，河南汝州46 7 59 9 2.汝州职业技术学院，河南汝州46 7 59 9）摘要：为探究不同饲养方式和饲料类型对鸭肠道微生物群落的影响，本研究采用末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）技术，对鸭肠道微生物群落的结构和多样性进行研究。结果表明，鸭肠道微生物群落具有较高的多样性和复杂性，其中包括多种细菌和古菌；不同饲养方式和饲料类型对鸭肠道微生物群落结构有一定影响，但差异不显著；鸭肠道微生物群落中存在着一些特定的菌群，这些菌群可能对鸭的生长和健康状态有一定的影响。本研究为深入了解鸭肠道微生物群落结构提供了重要的参考。关键词：T-RFLP；鸭；肠道微生物；群落结构中图分类号：S834文献标识码：B文章编号：16 7 3-10 8 5（2 0 2 3）0 9-0 0 0 6-0 5肠道微生物群落是指生活在肠道内的微生物群体，是鸭消化系统的重要组成部分。肠道微生物群落的组成和功能对于鸭的健康生长具有重要影响。因此，深入研究鸭肠道微生物群落的结构和功能，对于提高鸭的生产性能和保障鸭肉品质具有重要意义。鸭肠道微生物群落是由细菌、真菌、古菌、原生动物等多种微生物组成2 。这些微生物在鸭肠道内形成复杂的生态系统，相互作用，,共同参与鸭的消化、吸收和免疫等生理过程。鸭肠道微生物群落的主要功能包括：1）促进消化收稿日期：2 0 2 3-0 5-11第一作者简介：杨为敏（19 7 4一），女，本科，高级讲师，主要研究方向为家禽生产及疫病防治，E-mail：my x mz h y e a h.n e t。*通信作者简介：孟玉学（19 7 0 一），男，本科，正高级讲师，主要研究方向为畜禽养殖及疾病防治，E-mail：8 6 7 7 40 153?。和吸收。肠道微生物群落中的一些细菌能够分解鸭自身消化酶无法消化的成分，提高饲料利用率；2）维持肠道健康。肠道的有益微生物可产生有益的代谢产物，如短链脂肪酸等，抑制有害菌的生长，保持肠道微生态平衡，减少肠道疾病的发生；3）调节免疫功能。一些有益微生物能够调节鸭的免疫功能，增强鸭的免疫力，提高鸭的抗病能力3。末端限制性片段长度多态性分析（Terminalrestriction fragment length polymorphism,T-RFLP)是一种基于PCR扩增的DNA指纹技术，可用于2023年第45卷第9 期研究微生物群落的结构和多样性。该技术利用末端限制性酶对PCR扩增产物进行酶切，得到一系列不同长度的DNA片段，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，最终形成一条DNA指纹图谱。T-RFLP技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点，已广泛应用于微生物群落结构的研究5。本研究旨在通过T-RFLP技术分析鸭肠道微生物群落的结构和多样性，探究不同饲养方式和饲料类型对鸭肠道微生物群落的影响，为鸭肠道微生物群落的调控提供理论依据。本文具体研究内容包括：采集采用不同饲养方式和饲料类型的鸭肠道样品进行提取DNA；利用T-RFLP技术分析鸭肠道微生物群落的结构和多样性；对T-RFLP图谱进行聚类分析、主成分分析等统计学分析，探究不同饲养方式和饲料类型对鸭肠道微生物群落的影响。1材料与方法1.1样品采集和处理本研究共选取9 0 个北京鸭肠道样品，分为9个处理，每个处理10 个样品。鸭肠道样品选取时的考虑因素：1）日龄：不同日龄的鸭肠道微生物群落有所差异，因此应选择同日龄的成年鸭或幼年鸭进行样品采集；2）健康状态：选择健康、无用药记录的鸭进行肠道样品采集，以避免肠道微生物群落受到疾病或治疗药物等干扰。因此，在样品采集前，要对鸭进行全面的健康检查，确保其身体状况良好；3）饲养环境和饲料类型：鸭的饲养环境和饲料类型（大豆饼、豆粕、玉米、小麦）等因素可能会影响肠道微生物群落的组成和丰度，如果要比较不同饲料对肠道微生物群落的影响，应在相同的饲养环境下进行。样品采集：对鸭进行麻醉处理，切开腹部，取出肠道样品放入无菌离心管中，迅速送至实验室进行初步处理。初步处理具体步骤：用无菌剪刀将样品剪成小段，放人无菌离心管中，加入PBS缓冲液进行振荡混合，离心沉淀，去除上清液；将沉淀物用PBS缓冲液进行洗涤，再次离心，去除上清液；将沉淀物用无菌的离家禽科学心管保存在-8 0 冰箱中，以备后续试验使用。1.2DNA提取和PCR扩增1.2.1DNA 提取是本研究的重要步骤之一。将样品加入磨砂管中，加入磨砂珠和研磨液进行振荡研磨，直到样品完全破碎；将破碎后的样品用DNA提取试剂盒（碧云天生物技术有限公司，上海）提取DNA，按照试剂盒说明书的步骤进行操作。1.2.2PCR扩增本研究采用16 SrRNA基因V3V4区域作为扩增目标，将DNA样品用特定引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10 XPCR缓冲液2.5L，2.5mMd NT Ps 混合液2 L，10 M的16 SrRNA基因V3V4区域特异引物1L，T a qDNA聚合酶0.2 5L，D NA 样品1L，加ddH,O至总体积为2 5L。PC R反应条件为：预变性9 55min，变性9 530 s，退火5530 s，延伸7 2 45s，共循环30 次，最终延伸7 2 10 min。PC R扩增后，需要进行凝胶电泳检测，以确定扩增效果。1.3末端限制性片段长度多态性分析T-RFLP是一种快速检测微生物群落多样性的方法，原理是将PCR扩增产生的DNA片段用限制性内切酶消化，然后在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，最后通过荧光染色或放射自显影等方法进行检测。T-RFLP原理见图1。16SgenePCR ampificationSpeciesSpecles ESpedles CSpecies NumberofRFUs图1T-RFLP原理图（详见附录彩图）本研究采用MspI和HaelII 两种内切酶对PCR扩增产生的DNA片段进行消化，电泳分离产物通过荧光染色方法进行检测，最终得到研究报道DigestionWithRE200400600研究报道T-RFLP图谱。1.4数据处理和分析本研究采用PeakScanner软件对T-RFLP图谱进行数据处理，采用UPGMA聚类分析方法和主AProteobacteriaFirmicutesunidentifled_BacteriaBacteroidetesFusobacteriaTenericutesActinobacteriaOxyphotobacteriaAcidobacteriaChloroflexiQthersweighted-Unifracdistance00.10.20.32结果2.1饲料类型对微生物群落结构的影响表1为饲料类型对微生物群落结构的影响。由表1可知，不同饲料类型对鸭肠道微生物群落结构的影响差异明显。在饲料中添加大豆饼和豆的处理组，鸭肠道中乳酸菌的数量明显增加，而革兰氏阴性菌的数量明显减少。这可能是因为大豆饼和豆粕中含有大量的异黄酮类物质，这些饲料类型大豆饼豆粮玉米小麦2.2饲料添加剂对微生物群落结构的影响菌群添加前数量乳酸菌1 000革兰氏阴性菌800厌氧菌500China Poultry Science行分析。聚类分析和主成分分析等方法对微生物群落结构组成分析图见图2 所示。B0.070.40.20.00.20.250.50Relativeabundance in phylumlevel图2 鸭肠道微生物群落组成分析图（详见附录彩图）注：A：门水平上的微生物组成；B：主成分分析。表1饲料类型对微生物群落结构的影响菌群乳酸菌革兰氏阴性菌乳酸菌革兰氏阴性菌厌氧菌乳酸菌厌氧菌乳酸菌表2 饲料添加剂对微生物群落结构影响5 000200600Vol.45 No.9 2023成分分析等方法对微生物群落的组成和多样性进C0.751.00-0.4-0.6-0.9-0.6-0.30.00.3PC1(40.73%)物质可以促进乳酸菌的生长，同时抑制革兰氏阴性菌的生长。另外，在饲料中添加玉米和小麦的处理组，鸭肠道中厌氧菌的数量显著增加，而乳酸菌的数量明显减少。这可能是因为玉米和小麦中含有较高的淀粉含量，这些淀粉可以被厌氧菌利用产生大量的短链脂肪酸，从而促进厌氧菌的生长。喂前数量10050120608015090130饲料添加剂对微生物群落结构影响结果表2。添加益生菌后数量0.60.9单位：10 3CFU/g喂后数量200202203015010016090单位：10 3 CFU/g添加抗生素后数量5008002.0002023年第45卷第9 期由表2 可知，不同饲料添加剂对鸭肠道微生物群落结构的影响差异明显。在饲料中添加益生菌的处理组，鸭肠道中乳酸菌的数量明显增加，而革兰氏阴性菌的数量明显减少。这可能是因为益生菌可以竞争性地占据鸭肠道的生态位，从而抑制革兰氏阴性菌的生长。另外，在饲料中添加抗生素的处理组，鸭肠厌氧菌数量/饲养密度(10 CFU/g)正常1000高5000注：正常密度：4只/m；高密度：7 只/。由表3可知，不同饲养密度对鸭肠道微生物群落结构的影响差异明显。在高密度饲养条件下，鸭肠道中厌氧菌的数量明显增加，而乳酸菌的数量明显减少。这可能是因为高密度饲养会导致鸭肠道内的氧气含量降低，从而促进厌氧菌的生长。另外，在高密度饲养条件下，鸭肠道中的菌落总数明显增加，同时细菌的多样性和均匀度明显降低。这可能是因为高密度饲养会导致鸭肠道内的营养物质供应不足，从而促进细菌的繁殖，但是由于生态位的竞争，导致微生物群落的多样性和均匀度降低。3讨论本研究基于末端限制性片段长度多态性（T-RFL P）技术，对北京鸭肠道微生物群落结构进行了研究。结果表明，北京鸭肠道微生物群落结构呈现出较高的多样性，其中乳酸菌和厌氧菌是主要的优势菌群。这项研究为鸭肠道微生物群落结构的研究提供了一种快速、准确、高通量的分析方法。同时，该研究结果也为鸭肠道微生物的功能分析提供了重要的基础数据，有助于深人探究鸭肠道微生物群落与宿主健康之间的关系，为鸭肠道微生物的调控和优化提供科学依据。需要注意的是，本研究的样本仅来自于北京鸭这一种鸭的肠道，因此对于不同品种或不同环境的鸭家禽科学道中厌氧菌的数量显著增加，而乳酸菌的数量明显减少。这可能是因为抗生素可以抑制乳酸菌的生长，同时也可以抑制鸭肠道中的其他细菌，从而促进厌氧菌的生长。2.3饲养密度对微生物群落结构的影响不同饲养密度对鸭肠道微生物群落结构的影响结果见表3。表3不同饲养密度对鸭肠道微生物群落结构的影响乳酸菌数量/(10 CFU/g)5 0002.000研究报道菌落总数/多样性(10 CFU/g)10 00020000肠道微生物群落结构的研究还需要进一步探究。此外，T-RFLP技术虽然具有高通量和准确性等优点，但也存在着一定的局限性，如不能对微生物种类进行准确的分类和定量等问题，因此在实际应用中需要结合其他方法进行分析和验证。4结语本文的研究结果为深入了解鸭肠道微生物群落结构和功能提供了重要的科学依据，同时也为鸭的生产提供了重要的参考价值。未来，我们还需要进一步深入研究鸭肠道微生物群落的功能和代谢特点，以更好地指导鸭的饲养和管理。参考文献：1李献梅，王小芬，崔宗均.末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化.中国农业大学学报,2 0 0 9,14(4):1-9.2江欣倚，刘玲，熊靖飞，等.限制性末端片段长度多态性分析技术及其在肠道微生物研究中的应用.生物技术世界,2 0 16(2):30 7+30 9.3林炜铁，朱雅楠.末端限制性片段长度多态性技术分析硝化细菌微生物多样性.生物工程学报,2 0 10,2 6(4):48 3-48 8.4赵小刚，谭支良，汤少勋，等.指纹图谱技术在动物肠道微生物多样性研究中的应用.广西农业生物均匀度500.8300.6研究报道科学,2 0 0 7(4):350-355.5于萍，王加启，卜登攀，等.T-RFLP技术及其在动物胃肠道微生物群落多样性研究中的应用.乳业科学与技术,2 0 0 8(6):2 9 4-2 9 6.China Poultry Science6李红.末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展.安徽师范大学学报（自然科学版),2 0 0 6(6):58 2-58 5.Vol.45 No.9 2023Analysis of Intestinal Microbial Community Structure in Ducks Basedon Terminal Restriction Fragment Length PolymorphismYANG Weimin,HAN Dengge,MENG Yuxue(l.Ruzhou Secondary Vocational School,Ruzhou 467599,China)(2.Ruzhou Vocational and Technical College,Ruzhou 467599,China)Abstract:In order to explore the effects of different feeding methods and feed on theduck gut microbial community,IT-RFLP technique was used to study the intestinal microbialcommunity structure and diversity of ducks.The results showed that the intestinal microbialcommunity of ducks was highly diverse and complex,including a variety of bacteria and archaea.At the same time,different feeding patterns and feed types had certain effects on the intestinalmicrobial community structure of ducks,but the effects were not obvious.In addition,this studyalso found that there are some specific microbial communities in the gut of duck,which may havecertain effects on the growth and health of ducks.This study provides an important reference forunderstanding the structure in ducks.Keywords:T-RFLP;Ducks;Gut microbes;Community structure附录彩图第2 页：周龄、蛋重和季节对种鸡繁殖性能的影响受精率一受精蛋孵化率10090受精蛋健母雏率60504025图1受精率、孵化率和健母雏率随周龄变化情况第7-8 页：基于末端限制性片段长度多态性分析鸭肠道微生物群落结LabelledprimerFSpeclesSpecies ESpecies CSpeciesD30354016SgenePCRamplfication45周龄5055primerRLabelledDigestionwithRE606570NumberofRFUsFragmont0Aweighted-Unifracdistance00.10.20.3200图1 T-RFLP原理图B0.60.4Proteobacteriaunidentifled_BacteriaFirmicutesBacteroidetesFusobacteriaTenericutesActinobacteriaOxyphotobacteriaAcidobacteriaChloroflexiQthers00.25Relativeabundance in phylumlevel第1 2-1 6 页：现代肉种鸡生长发育的监测与评估4000.500.75图2 鸭肠道微生物群落组成分析图注：A：门水平上的微生物组成；B：主成分分析。6001.00longht(bp)0.20.0-0.2+0.4-0.6+-0.9-0.6-0.3PC1(40.73%)0.00.30.60.9图1胸肌指数评分图2评估种母鸡腹部脂肪沉积