离心技术与细胞器分离.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,离心技术,与细胞器的分离,1,一,实验目的,1,、以分离叶绿体、细胞核为例,掌握,离心机,的操作技术及两种不同的离心方法：,差速离心法、密度梯度离心法,;,2,、光镜鉴定各种细胞器的提取情况及了解,叶绿体、细胞核,的形态。,2,二 实验原理,离心技术,（,centrifugal technique,）是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离技术。,离心力,（,centrifugal force,，,Fc,）,相对离心力,（,relative centrifugal force,，,RCF,）,3,离心力（,centrifugal force,，,Fc,）,离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动时受到的一个向外的力。,离心力（,Fc,）的大小取决于,角速度,与,旋转半径,，即：,Fc=m,2,r,其中,是旋转角速度，以弧度,/,秒为单位；,r,是颗粒离开旋转中心的距离，以,cm,为单位；,m,是质量，以,g,为单位。,4,相对离心力（,relative centrifugal force,，,RCF,）,又称相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数。在文献中常用“相对离心力”或,“数字,g,”,表示。,RCF=(,m,2,r)/(mg)=,1.119105,n,2,r,式中,r,为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，以,cm,为单位；,g,为地球重力加速度（,980cm/sec,2,）；,n,为转子每分钟的转数（,rpm,）。,5,离心力的转换列线图,6,离心机,制备性,分析性,分析性超速离心机,普通离心机,冰冻离心机,台式（或地面式）普通离心机,大容量冰冻离心机,小于,0.6,万转,/,分,高速冰冻离心机,0.6-2.5,万,超速冰冻离心机,2.5-8,万或更高,概述,台式高、超速离心机,0.6-10,万转,/,分以上,离心机的基本分类,7,离心机的结构,离心机的主要部件为,转头,、主轴、电动机和传动装置、制动器、外壳和机座。,8,离心机的转头主要有：,角度转头（,angle-headed rotors,）、甩平式水平转头（,swing-out rotors,）,/,吊桶式转头（,swinging bucket rotors,）,水平转头,角度转头,9,离心技术类型,常用离心技术一般包括：,差速离心法（,differential velocity centrifugation,）,密度梯度离心法,(density gradient centrifugation),。,10,差速离心法,（,differential velocity centrifugation,）,采用,逐渐增加离心速度,或,低速和高速交替进行离心,，使沉降系数不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。,常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。,11,Figure 8-9,Molecular Biology of the Cell,(Garland Science 2008),The preparative ultracentrifuge,12,差速离心法,（,differential velocity centrifugation,）,13,密度梯度离心,原理：当不同颗粒存在,浮力密度差,时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。,等密度梯度离心一般常用,CsCl,、,RuCl,、蔗糖、甘油等做介质。,此法一般应用于物质的,大小相近，而密度差异较大,时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。,14,Density gradient centrifugation,15,Density gradient centrifugation,16,17,实验步骤,1,将材料用蒸馏水洗净。用滤纸吸干水后,去叶脉,称取,2,克叶片,用剪刀剪碎后放入研钵。,2,量取,10ml,匀浆,buffer,，先向研钵中倒入,5ml,后开始研磨。,3四层纱布过滤，收集,过滤液,到,10ml,离心管中，再将剩下的,5ml,匀浆,buffer,冲洗研钵后也过滤到管中，,5000rpm,离心,5,分钟,去上清。,4,加入,0.5%,TritonX-100,2.5ml,混匀，振荡后静置,3,分钟,.5000rpm,离心,5,分钟，去上清。,5,加入,1ml,CSK buffer,振荡混匀,可以用枪头轻轻吹打沉淀使其溶解,.,18,6,滤膜过滤（,300,目）,去掉未裂解的原生质体及裂解的细胞膜内溶物等大块杂质，收集,过滤液,。,以上步骤所提到的细胞核不纯,其中混杂有原生质体、线粒体、叶绿体,下面采用蔗糖密度梯度离心分离细胞核和叶绿体。,7.,把含有,2.3M,蔗糖,的,CSK buffer 3ml,加至于离心管底部,.,8.,再把,3ml,60%percoll,CSK buffer,轻轻的平铺于,7,的溶液上方,用移液枪加时一定要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上,.,这时应该能观察到溶液明显的分层现象,.,9.,然后把,6,中过滤溶液轻轻的平铺于,8,的溶液上方。观察分层现象。,10.,3200g,离心,32,分钟，溶液梯度层重新分布。,11.,分别吸取一些各层的溶液进行改良品红苯酚染色、镜检。观察不同大小不同密度的细胞器的分布情况以及他们的形态特征。,19,试剂,匀浆,buffer,：,5mM MES,6.8mM CaCl,2,11mM KH,2,PO,4,0.3M,山梨醇,0.3 M,甘露醇,0.4,PVP-30,CSK buffer,:100mM KCl,3mM MgCl2,1mM EGTA(PH8.0),10mM PIPES(PH6.8),300mM sucrose.,60%percoll CSK buffer,：,60%percoll,100mM KCl,3mM MgCl,2,1mM EGTA(PH8.0),10mM PIPES(PH6.8),300mM sucrose.,2.3M sucroseCSK buffer,:100mM KCl,3mM MgCl2,1mM EGTA(PH8.0),10mM PIPES(PH6.8),2.3M sucrose.,20,实验结果记录,细胞核,叶绿体,21,22,