多功能根际生防促生放线菌的分离鉴定及其对辣椒的益生效果.pdf

Journal of Agricultural Resources and Environment农业资源与环境学报 2023,40（4）:906-916http:/Screening,identification,and characterizations of antagonistic actinomycetes strains with plant growth-promoting properties and beneficial effects on pepperGAO Xiaomei1,LI Yang1,YU Miao1,AO Jing1,LIU Xiaohui1,SUN Yulu1,YAO Yanpo2,CHI Jingliang1（1.Microbial Research Institute of Liaoning Province,Chaoyang 122000,China;2.Agro-Environmental Protection Institute,Ministry ofAgriculture and Rural Affairs,Tianjin 300191,China）Abstract：The objective was to screen strains with excellent disease-controlling and plant growth-promoting properties from healthypepper rhizosphere and apply them to bio-barrier soil,so as to provide probiotic resources for biocontrol of pepper root rot.The plateconfrontation method was used to screen biocontrol strains to Fusarium solani,the causal agent of pepper root rot.The nitrogen fixation,phosphate solution,potassium solution,3-indole acetic acid（IAA）,siderophore,cellulase,and protease producing capacity anddegradation of phenolic acids of the strains were measured.The actinomycetes were identified by morphological,physiological,biochemical,and 16S rRNA gene sequence analysis.In field experiments,plant growth-promoting effects were analyzed by measuring多功能根际生防促生放线菌的分离鉴定及其对辣椒的益生效果高晓梅1，李杨1，于淼1，敖静1，刘晓辉1，孙玉禄1，姚彦坡2，池景良1（1.辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000；2.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191）收稿日期：2022-06-21录用日期：2022-10-19作者简介：高晓梅（1981），女，蒙古族，辽宁喀左人，研究员，研究方向为土壤微生态与植物健康。E-mail：基金项目：辽宁省科技创新领军人才项目（XLYC2002048）；辽宁省自然科学基金项目（2020-MS-345）；辽宁省农业科学院土壤微生态学科建设项目（2019DD154522）Project supported：Liaoning Leading Talent in Science and Technology（XLYC2002048）；Liaoning Natural Science Foundation（2020-MS-345）；Project forSoil Microecology Discipline Construction of Liaoning Agriculture Science Academy（2019DD154522）摘要：从健康辣椒根际土壤筛选具防病促生功能的菌种并应用于生物障碍土壤，可为辣椒提质增产和根腐病的防治提供优质的菌剂资源。本研究以辣椒根腐病的病原菌腐皮镰孢菌（Fusarium solani）为靶标菌，采用平板对峙法筛选优良生防菌株，对其固氮、溶磷、解钾、分泌3-吲哚乙酸（3-indole acetic acid，IAA）、产铁载体、产纤维素酶和蛋白酶、利用酚酸类连作障碍物质等能力进行定性和定量测定。采用形态学、生理生化及16S rRNA基因序列对分离菌株进行鉴定，并采用田间原位栽培试验检测其生防和促生效果。结果表明，从设施连作抗病辣椒根际土中获得6株具有抑菌作用的放线菌，通过定性、定量测试发现菌株G-1拮抗效果最强，其对设施蔬菜5种常见病原菌均具有较好的抑制效果，抗菌谱广，且具有分泌IAA、产铁载体、产纤维素酶和蛋白酶、溶解有机磷、利用酚酸类化感物质等特性。结合形态学、生理生化及 16S rRNA 进化树分析结果，将其鉴定为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）。田间原位栽培试验显示，G-1菌剂对辣椒根腐病具有较好的防病作用，可显著降低根腐病的病情指数，促进辣椒根系生长，且可使辣椒增产31.04%。研究表明，弗氏链霉菌G-1具有优良的防病促生功能，其固体菌剂的田间应用对辣椒根腐病具有较好的防治效果，且对辣椒具有明显的促生增产作用，可作为辣椒益生菌剂的候选菌株资源。关键词：促生菌；辣椒根腐病；拮抗菌；链霉菌；应用中图分类号：S436.418文献标志码：A文章编号：2095-6819（2023）04-0906-11doi:10.13254/j.jare.2022.0391高晓梅，李杨，于淼，等.多功能根际生防促生放线菌的分离鉴定及其对辣椒的益生效果J.农业资源与环境学报,2023,40（4）:906-916.GAO X M,LI Y,YU M,et al.Screening,identification,and characterizations of antagonistic actinomycetes strains with plant growth-promoting propertiesand beneficial effects on pepperJ.Journal of Agricultural Resources and Environment,2023,40（4）:906-916.2023年7月http:/高晓梅，等：多功能根际生防促生放线菌的分离鉴定及其对辣椒的益生效果辣椒是我国北方保护地广泛栽培的蔬菜，受设施土壤高强度利用、温室环境、老旧蔬菜基地多年连作等因素的影响，辣椒根腐病的频繁发生给辣椒产业发展带来巨大挑战1。镰孢菌（Fusarium sp.）是辣椒根腐病的主要病原菌，近年来保护地辣椒深受其害，已使个别年份减产30%50%，给农民造成巨大的经济损失2-4。为了防病增产，大量使用化学药剂和肥料已成为保护地生产常态，不但破坏土壤的生态平衡，致使土传病害和连作障碍愈加严重，也给蔬菜绿色、安全生产带来隐患。因此，蔬菜“减肥增效”及土传病害的科学防控成为亟待解决的关键问题，利用微生物菌剂（菌肥）进行病害管控及土壤养分调节已成为生态友好型综合措施的一大趋势。国内外报道的土传病害的生防微生物有很多，包括真菌、细菌、噬菌体和放线菌等，其中部分产品已实现商品化生产，且在病虫害综合防治和农业可持续发展中发挥着越来越重要的作用。一些微生物及其代谢产物兼有生防和营养的双重功能，将分别具有营养和生防的微生物菌剂复配后也可具有明显的防病和促长等作用，这为微生物菌剂的开发提供了思路和借鉴。放线菌是抗生素的主要产生类群，研究表明一些生防放线菌不仅能产生活性物质，抑制病原菌的生长，还会产生特殊物质促进植物的生长发育，在农作物病害生物防控方面具有重要作用。目前关于植物根际促生菌（Plant Growth Promoting Bacteria，PGPB）的研究已有大量报道，它们可以分泌某些化学物质（如生长素、有机酸等）直接促进植物生长，也可通过改变土壤中一些不可利用元素的形态，使之更有利于植物吸收，从而改善土壤养分循环来促进植物生长（如固氮、溶磷、产铁载体、分解纤维素等），还可通过降解酚酸类化感物质或抑制病原微生物间接促进植物生长发育5-6。开发功能多样的微生物菌剂或合成菌群制剂能够在保证蔬菜增产增收的基础上，管控土壤连作障碍并保障食品安全，因此具有巨大的发展潜力。本研究以辣椒根腐病病原菌为靶标菌，对采自辽宁省朝阳县设施连作温室中的抗病土壤进行拮抗放线菌的筛选，通过定性和定量测试，筛选同时具有抑菌作用和能够分泌 3-吲哚乙酸（3-IndoleAcetic Acid，IAA）、产铁载体、固氮、解磷、产纤维素酶和蛋白酶及利用连作障碍酚酸类植物自毒物质等功能的有益菌株，并利用分子生物学技术结合部分形态学及生理生化特征对其进行分类鉴定，将所获益生菌株制备的菌剂采用田间原位试验验证其对辣椒促生增产及根腐病防治的作用，以期为辣椒根腐病的生防微生物菌剂（菌肥）研发与推广提供优良菌种资源及田间应用基础。1材料与方法1.1 试验材料与试验地概况供试病原菌辣椒根腐病病原菌（Fusarium solani）、辣椒菌核病病原菌（Sclerotinia sclerotium）、黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢菌黄瓜专用型（F.oxysporium f.sp.cucumarinum）、番茄早疫病病原菌腐皮链格孢（Alternaria solani）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）均由沈阳农业大学植物保护学院提供。试验设在位于辽宁省朝阳市朝阳县柳城街道拉拉屯村的设施辣椒连作8年地块，海拔14 m，全年平均气温约 9，年降水量 450500 mm，无霜期 120155 d，肥力中等，历年辣椒根腐病发病率10%25%，耕层土壤有机质含量 18.65 gkg-1、全氮 709.26 mgkg-1、全磷 113.82 mgkg-1、全钾 26.47 gkg-1、pH 值6.92、镰孢菌活菌数1.075104CFUg-1。1.2 试验设计试验前采用稀释涂布平板法测定活菌数，确保其符合农用微生物菌剂活菌数标准（2.0108CFUg-1）。pepper yield and disease index of root rot.A total of six strains of biocontrol actinomycetes showed an antagonistic effect on F.solani.Strain G-1 was explored for the strongest inhibition rates to the five pathogens of the vegetable in greenhouse,and the superior charactersof IAA,siderophore,cellulase,protease producing,organic-phosphorus dissociation and degradation of phenolic acids.Combined withcolony morphological,physiological,biochemical,and 16S rRNA phylogenetic tree analysis,strain G-1 was identified as Streptomycesfradiae.In-situ field experiment showed that the strain G-1 had obvious disease prevention effect on pepper Fusarium root rot（P0.05）.Ithad certain growth-promoting effect on pepper plants,and G-1 increased the yield of pepper by 31.04%.S.fradiae（G-1）is considered aprobiotic resource for pepper green agriculture,and we provide superior microbial inoculants that cater to the yield of pepper and thebiocontrol of Fusarium root rot.Keywords：plant growth promoting bacteria（PGPB）;pepper Fusarium root rot;antagonistic bacteria;Streptomyces fradiae.;application 907http:/农业资源与环境学报 第40卷 第4期设施辣椒品种为赤峰牛角椒，定殖前施用鸡粪发酵农家肥作为底肥，用量约200 g 株-1，以此为对照（CK），另设置菌剂施用量为0.5、1.0、1.5 g 株-13个处理，每个处理3畦，上述所有处理设置3次重复。定殖1个月后调查记录根系生长和辣椒根腐病状况，整个生育期间田间管理按常规进行，期间统计辣椒根腐病的发病率和整个生长季（5个月）的产量。病情指数（DI）=（各级病株数相对级数值）/（调查总株数最高病级数值）100%，防治效果=（CK组病情指数-处理组病情指数）/CK组病情指数100%。1.3 试验方法1.3.1 拮抗放线菌菌株的分离筛选菌株的分离筛选：本研究选取辽宁省朝阳县设施连作健康辣椒温室5栋，拔出辣椒植株后采用抖根法采集根际土壤样品15份。取1 g土样放入99 mL无菌生理盐水中，振荡30 min，以10倍梯度稀释后，分别将10-3、10-4、10-5稀释梯度的土壤悬浮液100 L涂布于含有50 gmL-1重铬酸钾的高氏1号固体平板，32 培养5 d，从中挑选放线菌单菌落进行划线纯化，将纯化得到的菌株接种于高氏1号斜面培养基中保存备用。辣椒根腐病拮抗菌筛选：吸取100 L辣椒根腐病病原菌（F.solani）孢子悬浮液均匀涂布于高氏1号固体培养基，在平板上放置无菌滤纸片（直径5 mm）备用。将分离获得的放线菌菌株接种于液体高氏1号培养基，32、180 rmin-1培养3 d，吸取6 L培养液滴于滤纸片中央，以等量未接菌的培养液为对照，筛选对辣椒根腐病具有抑菌作用的放线菌菌株。1.3.2 拮抗菌生防和促生功能评估菌株促生和营养利用特性定性检测：分泌植物激素 IAA 能力的定性测定采用 Salkowski 试剂比色法7-9；固氮能力定性采用阿须贝氏培养基（Ashby）；溶磷定性采用 Pikovaskaias 无机磷培养基（PKO）10和蒙金娜有机磷培养基（MJN）11；活化钾定性采用亚历山大罗夫培养基12；产铁载体定性采用铬天青培养基（CAS）；产纤维素酶定性采用刚果红纤维素培养基；产蛋白酶定性采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）。上述鉴别培养基定性采用水解圈（D）与菌落直径（d）比值衡量菌株活性的高低（D/d）。利用酚酸类植物自毒物质能力以高氏1号基础培养基（不添加淀粉）为对照，分别添加对羟基苯甲酸、肉桂酸、没食子酸、咖啡酸和香草酸代替可溶性淀粉进行检测。拮抗菌株抑菌谱测定：采用平板对峙法测定拮抗菌株对包含辣椒根腐病菌在内的5株设施作物常见病原菌辣椒根腐病病原菌（F.solani）、辣椒菌核病病原菌（S.sclerotium）、黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰孢菌黄瓜专化型（F.oxysporium f.sp.cucumarinum）、番茄早疫病病原菌腐皮链格菌（A.solani）和立枯丝核菌（R.solani）的拮抗活性，方法同上述拮抗菌筛选。将生长良好的5种病原菌制备成病菌悬浮液，将无菌滤纸片（直径5 mm）分别在悬浮液中浸泡成病原菌菌片，制作浸泡G-1菌株发酵液的菌片后置于PDA平板上进行对峙培养，以未接菌的培养液为对照，每个试验重复3次。31 培养5 d，测定处理组及对照组病原菌菌落直径，并计算抑菌率。抑菌率（对照组病原菌菌落直径-处理组病原菌菌落直径）/对照组病原菌菌落直径100%，同时以抑菌带宽（拮抗菌的菌落边缘到病原菌的距离）衡量抑菌效果。IAA分泌定量测定：将保存的菌株挑取少许分别接入高氏1号和添加L-色氨酸（m V=0.05%）的高氏1号液体培养基中，在30、180 rmin-1条件下振荡培养，之后每 48 h采用 Salkowski显色法测量 IAA分泌量，每组设置3个平行，将发酵液置于50 mL离心管中10 000 rmin-1离心10 min，取上清液按照Glickmann等7的方法测定吸光值。标准曲线采用分析纯IAA进行制备，将50 mgL-1的IAA标准液浓度梯度稀释为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mgL-1，采用Salkowski显色法测定吸光值（OD530），得到标准曲线为y=31.946x+5.808 8（R2=0.994 3）。铁载体活性检测：将活化菌株接种于MKB液体培养基中，在30、120 rmin-1条件下振荡培养48 h，离心取 3 mL上清液。将上清液与 CAS检测液 3 mL均匀混合，每组设置3个平行，反应1 h，于630 nm处测定吸光值（As）。对照组为不接菌MKB液体培养基，吸光值（Ar）测定方法同上。铁载体活性计算公式13：铁载体活性=（Ar-As）/Ar100%。纤维素酶和蛋白酶定量测定均采用农用微生物菌剂酶活国标方法（GB 202872006）。1.3.3 生防促生菌株分类鉴定形态学观察：将拮抗菌株在高氏 1 号培养基上28 下划线培养72 h，观察记录菌落形状、大小、表面形态、颜色、边缘及透明度等特征，并在光学显微镜下观察菌体形态。生理生化特征：拮抗菌株的生理生化指标测定参照 常见细菌系统鉴定手册14和 伯杰细菌鉴定手册15。分子生物学鉴定：采用DNA提取试剂盒（OMEGA）9082023年7月http:/高晓梅，等：多功能根际生防促生放线菌的分离鉴定及其对辣椒的益生效果提取菌株的DNA，琼脂糖凝胶电泳法分析DNA的纯度。以菌株G-1基因组为模板，扩增引物选取16S rRNA基因扩增的通用引物27F和1492R，其序列为27F：5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3，1492R：5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3（Y=C/T）。扩增体系（50 L）：15 L 2Taq PCR Master Mix、1 LDNA 模板、0.5 L 引物 27F、0.5 L 引物 1492R、13L ddH2O。PCR 扩增条件：94 5 min；94 40 s、57 1 min、72 90 s，30个循环；72 10 min。DNA扩增及测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。将测得的序列在EZ BioCloud模式菌株数据库中进行序列比对，选取亲缘关系远近不同的模式菌株基因序列，使用Mega X软件Neighbor-joining法（自展数为1 000）构建并分析菌株系统发育进化树。1.3.4 生防促生菌剂对辣椒根腐病田间防治效果及对辣椒促生增产效果生防促生G-1菌剂的制备：将弗氏链霉菌划线转接到高氏1号平板中，置于培养箱内2832 恒温培养57 d获得活化菌株。挑取纯培养菌体接种于液体培养基中，在32、180 rmin-1条件下摇床振荡培养96 h即为种子液。以耕田土、稻壳粉、麸皮、稻壳、生石灰、硫酸铵为基质，按照料水比1 0.35混匀后装入食用菌菌袋灭菌，将种子液按体积质量比5%接种于无菌固体培养料。第一阶段在31 下培养5 d，此过程发酵后表面遍布白色孢子丝，之后将固体培养基从菌袋倒入曲盘；第二阶段在2028 下培养5 d进行产孢发酵，该阶段产生大量孢子，物料表面变为粉白色（专利号：ZL202011094753.5），两阶段固体发酵结束后即可得到富含孢子且适于长时间保存的微生物菌剂。1.4 数据处理与分析采用 Microsoft Excel 2010 进行数据整理，采用SPSS 25中Duncan 新复极差法进行差异显著性分析（P0.05），使用Origin 2018制图，运用Mega X完成基因序列处理及系统发育树构建。2结果与分析2.1 拮抗放线菌的初筛以辣椒根腐病病原菌为靶标菌，共筛选获得6株菌落形态不同且对辣椒根腐病病原菌具有抑制作用的放线菌菌株。其中菌株G-1抑菌效果最强，其次是菌株GL-12和GZ-26，菌株GC-6、GF-8和GX-15拮抗活性稍低（图1）。2.2 菌株促生活性2.2.1 菌株养分转化能力由表1定性检测结果初步判定，6株生防菌中有注：D/d表示透明圈与菌落直径的比值；+表示阳性反应，-表示阴性反应；数据为平均值标准差（n=3）。下同。Note：D/d means transparent circle to colony diameter ratio；+indicates positive reaction；-indicates negative reaction；data are meansstandarddeviation（n=3）.The same below.表1 6株菌株促生活性检测Table 1 Promoting growth features of the six strains菌株StrainG-1GC-6GF-8GL-12GX-15GZ-26固氮Nitrogenfixation+溶磷Phosphatesolution（D/d）溶解有机磷Organic-phosphorusdissociation（D/d）+（1.2600.010）解钾Potassiumsolution（D/d）铁载体活性Siderophores productioniron carrier activity/%+（21.54）+（38.68）IAA分泌量IAAproduction+降解纤维素Cellulosedegradation（D/d）+（3.3920.414）+（1.4520.108）降解蛋白Proteindegradation（D/d）+（2.0890.103）图1 不同放线菌发酵液抑菌效果Figure 1 Antibacterial effects of the fermentation broth fromdifferent actinomyces不同小写字母表示处理间差异显著（P0.05）。Different letters indicate significant differences at P0.05 level.909http:/农业资源与环境学报 第40卷 第4期固氮菌3株、溶磷菌1株、产铁载体菌2株、产IAA菌1株、降解纤维素菌2株、降解蛋白菌1株。菌株G-1具有固氮、溶解有机磷、产铁载体、产IAA、产纤维素和蛋白酶的能力；菌株GZ-26具有固氮和产铁载体能力；菌株GL-12具有降解纤维素的能力；菌株GC-6具有固氮能力。结合抑菌活性指标，对比各菌株生防促生性能，菌株G-1产IAA、溶解有机磷、产铁载体、产纤维素酶和蛋白酶等综合性能优越，故选定其作为进一步研究的供试菌株（图2）。按照国标方法测定G-1发酵上清液酶活性，以羧甲基纤维素钠为标准品测得纤维素酶活性为139.90 U，以干酪素为标准品测得蛋白酶活性为41.28 U，说明G-1菌株具有较高的分解纤维素和蛋白的能力。2.2.2 菌株G-1分泌植物激素能力利用 Salkowski试剂定性检测发现，菌株 G-1具有产生植物生长激素IAA的能力。由图 3 可知，不同培养条件下，生防菌G-1产IAA的能力在产量和产生时间上均存在一定差异。在高氏1号液体培养过程中（图3a），IAA的含量从第2天的5.679 mgL-1逐渐增至第14天的10.735 mgL-1。而在添加0.05%L-色氨酸这一IAA重要前体物质的高氏1号液体培养条件下（图 3b），第 2 天的 IAA 产量即可达 58.846 mgL-1，第4天可高达90.785 mgL-1，随着培养时间延长IAA含量趋于平稳，第10天时最高，为92.313 mgL-1，之后IAA含量有所下降。结果表明，G-1是一株具有产IAA能力的促生菌株，IAA的产量受培养条件、培养时间等因素的影响。2.2.3 菌株G-1利用酚酸类植物自毒物质能力由表2可知，菌株G-1对5种检测的酚酸类植物自毒物质表现出不同利用能力，其分解利用对羟基苯甲酸、肉桂酸和香草酸的能力较强，在500 mgL-1的浓度下菌株长势优于阴性对照，与阳性对照无差别，说明菌株G-1可以将其作为营养来源分解后用于自身生长。在100 mgL-1的浓度下，菌株G-1长势不受没食子酸和咖啡酸影响，但当浓度提高到500 mgL-1时，菌株生长受限，呈现一定的毒害作用，表明该菌株图2 菌株G-1固氮、溶解有机磷、产铁载体、水解纤维素和蛋白能力Figure 2 Capacity of nitrogen fixation，organic-phosphorus dissociation，siderophore production，hydrolysis celluloseand protein of strain G-1IAA分泌量IAA production/（mgL-1）（b）含0.05%L-色氨酸高氏1号培养基Gauzes synthetic medium with 0.05%L-tryptophan2468培养时间Incubation time/d11010090807060101214IAA分泌量IAA production/（mgL-1）（a）高氏1号培养基Gauzes synthetic medium2468培养时间Incubation time/d121086101214图3 菌株G-1分泌植物激素IAA能力Figure 3 IAA secreting ability of strain G-1固氮Nitrogen fixation溶解有机磷Organic-phosphorus dissociation产铁载体Siderophore production水解纤维素Hydrolysis cellulose水解蛋白Hydrolysis protein 9102023年7月http:/高晓梅，等：多功能根际生防促生放线菌的分离鉴定及其对辣椒的益生效果对没食子酸和咖啡酸耐受能力有限。2.3 菌株G-1的抑菌谱由表3可看出，菌株G-1对供试植物病原菌均有一定的抑制效果，对立枯丝核菌和辣椒菌核菌的抑菌率最高，分别为64.7%和62.6%，显著高于对其他病原菌的抑菌率（P0.05）。菌株G-1对腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌的平均抑菌率分别为50.3%和49.8%，对腐皮链格孢的平均抑菌率为44.5%，表明菌株G-1对多种保护地常见病原真菌均有较好的抑制效果，具有广谱抑制作用。2.4 菌株G-1的鉴定2.4.1 菌株形态学及生理生化特征将菌株G-1接种于高氏1号固体培养基上，31 培养 3 d，形成圆形或近似圆形的白色菌落，菌落致密、干燥、不透明，菌丝难以挑取，气生菌丝呈粉白色，基内菌丝呈浅黄色，无可溶性色素。菌落随培养时间延长逐渐增大，直径 47 mm，表面粗糙、扁平、不规则，培养5 d后孢子丝逐渐变为孢子覆盖于菌落表面，形成粉末状菌落，呈白色至肉粉色，接菌环易于挑取，划线培养形态见图4a。孢子丝柔曲，呈分枝丝状，直径约 0.6 m（图 4b），孢子卵圆形或椭圆形（图 4c）。革兰氏染色结果为阳性，生理生化鉴定结果（表4）显表2 菌株G-1酚酸类物质利用能力Table 2 Degradation of phenolic acids of strain G-1注：+代表生长正常；+代表生长一般；+代表生长较差。Note：+indicates strong growing；+indicates normal growing；+indicates weak growing.表3 菌株G-1对保护地5种常见病原真菌的抑菌效果及抑菌率Table 3 Antibacterial activity of strain G-1 against five common plant pathogenic fungi项目Item抑菌效果Antagonistic effect抑菌率Inhibition rate/%腐皮镰孢菌F.solani+50.30.9b尖孢镰孢菌F.oxysporium+49.81.1b腐皮链格孢A.solani+44.51.5c立枯丝核菌R.solani+64.71.7a辣椒菌核菌S.sclerotium+62.61.3a注：抑菌带6 mm表示为“+”；不抑制表示为“”。同行不同小写字母表示处理间差异显著（P0.05）。Note：+indicates week inhibition（the radius6 mm）；indicates no inhibition.Different letters in the same line mean significant difference at P0.05 level.培养基Medium高氏1号培养基（阳性对照）Gauzes synthetic medium（Positive CK）高氏1号基础培养基（阴性对照）Gauzes synthetic medium without starch（Negative CK）含对羟基苯甲酸培养基Medium with p-hydroxybenzoic acid含没食子酸培养基Medium with gallic acid含肉桂酸培养基Medium with cinnamic acid含咖啡酸培养基Medium with caffeic acid含香草酸培养基Medium with vanillic acid浓度 Concentration/（mgL-1）100500100500100500100500100500G-1长势G-1 growth+a：高氏1号培养基5 d菌落形态（正反面）；b：孢子丝；c：孢子。a：Colony on Gauzes synthetic medium in 5 d（surface and bottom）；b：sporophyllum；c：spore.abc图4 菌株G-1形态特征（1 000）Figure 4 Morphological characters of strain G-1（1 000）911http:/农业资源与环境学报 第40卷 第4期示，菌株G-1能使明胶液化，无色素，使牛奶凝固并迅速胨化，使淀粉水解，能分解纤维素，能利用色氨酸生成吲哚，能还原硝酸盐，不产生H2S和黑色素，可利用D-葡萄糖、D-果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、棉子糖、肌醇和D-甘露醇。2.4.2 菌株G-1 16S rRNA序列测定分析与系统发育进化树构建以菌株 G-1 总 DNA 为模板，经 16S rRNA 基因PCR扩增和产物测序后得到全长1 424 bp的基因片段，经上海生工生物技术公司测序后，将扩增序列在EZ BioCloud网站上进行同源性比对，发现菌株G-1与弗氏链霉菌模式菌株 DSM 40063 序列相似度为99.93%。选取不同相似度的7株近源种模式菌株，以及GCM模式菌株数据库中一株弗氏链霉菌专利菌株NRRL B-1195进行比对，利用Mega X构建系统发育进化树（图5）。由图5可知，菌株G-1与模式菌株同源性较高，结合菌株形态学特征和生理生化检测结果，将菌株G-1鉴定为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）。菌株核酸序列已上传至NCBI核酸数据库（Sequence ID：KM007095.1），因其菌株特性优异且田间应用效果较好，菌剂制备及应用已申报专利保护。2.5 G-1菌剂对辣椒根腐病田间防治效果及其对辣椒促生增产效果G-1菌剂在设施辣椒田间原位应用试验结果（图6）表明，移栽1个月后施用G-1菌剂的处理辣椒根系发达，主根更长，侧根较多且细，而对照处理主根不长，须根较短小且数量少，表明菌株对苗期辣椒根系的生长发育具有明显促进作用，其中菌剂施用量为1.0 g株-1时根系发育最佳。同时，施用菌剂处理较单施农家肥对照辣椒根系腐烂比例降低，根腐病的感病程度也显著降低。由表5可见，施用菌剂的处理较单独施用农家肥的对照产量明显提高（P0.05），辣椒平均产量可达3 6804 010 kg 亩-1（1亩667 m-2），比单施农家肥的对照增产 620950 kg亩-1，增产率为20.26%31.04%。辣椒根腐病病情指数为 11.07%15.99%，比单施农家肥对照的发病率和感病程度均有所降低，防治效果可达30.81%52.09%。3讨论土传病虫害多发是土壤连作障碍的主要表现，已危害70%以上的园艺用地16。众所周知，土传病病原微生物是园艺作物最主要的连作生物障碍因子，设施黄瓜、番茄、辣椒、菜豆、三七、韭菜等都深受其害17-20。生防促生菌（PGPB）作为一种新型微生物菌肥，具有显著的促生作用以及有效的生防优势，利用其代替化学药剂进行连作障碍的防治成为研究者的关注重点，目前已被中国、美国、德国、加拿大等 70图5 菌株G-1的邻接法系统发育进化树Figure 5 Neighbor-joining phylogenetic trees based on 16S rRNA sequences of strain G-1表4 菌株G-1生理生化特征Table4 PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofstrainG-1试验项目Item革兰氏染色 Gram stain淀粉水解Starch hydrolysis明胶液化Glutin hydrolyzation硝酸盐还原Nitratereduced nitrite纤维素分解Cellulose decomposition牛奶胨化Milk peptonization黑色素产生Melanin-like productionH2S产生H2S production吲哚试验Indole testV-P试验V-P test结果Result+试验项目Item葡萄糖Glucose蔗糖Sucrose果糖Fructose麦芽糖 Maltose阿拉伯糖 Arabinose鼠李糖Rhamnose乳糖Lactose棉子糖Raffinose肌醇InositolD-甘露醇D-Mannitol结果Result+9122023年7月http:/高晓梅，等：多功能根际生防促生放线菌的分离鉴定及其对辣椒的益生效果多个国家成功开发应用。Kazerooni等21研究发现生防菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）田间应用能够促进辣椒生长，抑制灰霉病和链格孢病的发生，提高辣椒对病害的抵抗能力。撖冬荣等22分离获得 9 株多功能根际促生菌，其微生物菌剂对莴笋具有良好的促生效果。目前，微生物肥料在我国已普遍使用，主要有根瘤菌生物肥、溶磷菌生物肥、解钾菌生物肥、联合固氮菌生物肥以及促生菌生物肥。植物的自毒作用也是导致连作障碍发生的重要原因，随着连作年限的增加，酚酸类自毒物质在土壤中蓄积，使作物品质下降、产量降低、病虫害频发，严重威胁农业生产安全23。土壤中蓄积的酚酸类物质在较低浓度下就可以造成潜在的连作障碍，肉桂酸浓度在0.25 mmolL-1（37 mgL-1）时即可显著抑制胚根伸长，对作物生长产生不利影响24。本研究中酚酸物质的检测浓度为100 mgL-1和5