基于高通量测序对呼伦贝尔陶顺阿尔山细菌群落多样性的研究.pdf

基金项目:内蒙古自治区蒙医药协同创新培育中心项目()内蒙古自治区“草原英才”人才项目()作者简介:陈英松 男教授博士 研究方向为蒙医传统疗术学:.邓彩霞 女博士研究生 研究方向为蒙医传统疗术学:.陈英松与邓彩霞为并列第一作者 通讯作者收稿日期:基于高通量测序对呼伦贝尔陶顺阿尔山细菌群落多样性的研究陈英松 邓彩霞 模 日 斯 琴 白 龙(.内蒙古民族大学 蒙医药学院内蒙古 通辽.内蒙古医科大学 蒙医药学院 内蒙古 呼和浩特)摘 要 对内蒙古呼伦贝尔陶顺阿尔山水体与沉积物的细菌群落结构和多样性进行 基因(区)高通量测序 运用 高通量测序平台共获得 条优化序列 结果显示水体中最主要的细菌类群为变形菌门()而沉积物样品中的主要优势类群为盐厌氧菌门()细菌在属分类水平上水体中优势菌群为嗜盐单胞菌属()、冷弯菌属()、盐厌氧菌属()沉积物样品中优势菌群为盐厌氧菌属、盐单胞菌属、未分类菌()其中存在大量的未知物种 陶顺阿尔山水体与沉积物中存在着丰富的微生物群落且差异性大未知菌种居多本研究首次阐明了陶顺阿尔山细菌群落的多样性为今后开发和利用陶顺阿尔山的功能菌群提供参考关键词 陶顺阿尔山高通量测序水体与沉积物细菌群落中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.).().微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .内蒙古呼伦贝尔地区盐湖资源丰富其中海拉尔盆地是盐湖分布的稠密区分布着许多大大小小的盐碱湖 占呼伦贝尔高原盐湖数量的 如呼伦湖、达赖诺尔、陶顺阿尔山等海拉尔盆地位于呼伦贝尔中心地段高平原地貌区地形波状起伏同时也是地表水与地下水的汇集区该地区气候为半干旱大陆性气候具有降水稀少蒸发量大的特点为盐碱湖的形成提供了先决的地域及气候条件 另外盐湖作为特殊的水环境是嗜盐微生物生长繁殖的最有利场所是科学家探索极端微生物的摇篮 近年来科学家对于嗜盐微生物的研究颇多主要集中在嗜盐菌多样性、嗜盐机制、产酶特性等方面 基于青海湖、茶卡盐湖、察尔汗盐湖、海拉尔地区碱湖等大量盐湖的研究表明盐湖多以厚壁菌门()、变形菌门()、拟杆菌门()和放线菌门()及芽胞杆菌属()、嗜盐单胞菌属()、假单胞菌属()、大洋芽胞杆菌属()等为优势菌群进一步研究发现高盐环境中生存的嗜盐菌对盐度有一定的依赖性并形成独特的结构物质通过产生极端酶、细胞内积累相容性物质如海藻糖、脂肪酶、四氢嘧啶等小分子物质的方式来抵抗外界的盐环境 而这些物质在环境修复、生物医药、污水处理、农业生产甚至在化妆品等领域具有广阔的应用前景 陶顺阿尔山位于内蒙古呼伦贝尔市新巴尔虎左旗吉布胡郎图苏木该湖属于典型的半干旱区盐碱湖 湖面海拔.面积大约.平均降水量不超过 但蒸发量却高达 以上且日照时间长、昼夜温差大 陶顺阿尔山的黑泥因在治疗皮肤病、风湿病、妇科病等方面的独特疗效而在当地广为流传 研究发现陶顺阿尔山中含有多种对人体有益的微量矿物质具有改善循环、提高免疫力、美容等功效而这种有益微量元素及离子的溶出不仅与地球化学作用有关更离不开其中微生物的作用 研究人员从陶顺阿尔山黑泥中分离出一株嗜盐微生物并将其命名为 该菌株属于厚壁菌门嗜碱菌属()近年来对陶顺阿尔山的研究主要集中在盐湖成分、医疗作用等方面而对微生物资源的研究很少尚未深入涉及其微生物领域由于陶顺阿尔山特殊的地区性及地域性的特点其中可能含有丰富的极端微生物资源 因此本研究采用高通量测序技术对不同地点的随机取样进行陶顺阿尔山微生物的群落结构分析这对系统了解陶顺阿尔山水体和黑泥中微生物群落的多样性挖掘新的菌种资源开发利用新的生物活性产物具有重要的实际意义 材料与方法.材料.样品采集 采样地点:内蒙古自治区呼伦贝尔市新巴尔虎左旗吉布胡朗图苏木陶顺阿尔山(海 拔 高 度.东 经 北 纬)采样时间:年 月下旬采样点位置:泥样品以湖边为中心点分别采集离湖边外侧、(进人池)边缘区及湖内、的共 个采样点每个采样点周边取 个样品后混合为一个样品 水样品采样点为湖周边洗泥池、进人池里的沉积水、湖水 点采样 水样品采集后采用真空抽滤泵用.及.大小的滤膜富集收集(表)采样时佩戴一次性手套采集的样品装入 无菌离心管中用干冰运送到实验室表 陶顺阿尔山水体和沉积物样品编号 采样地点(泥样品)样品编号采样地点(水样品)样品编号(滤膜孔径)离湖边外侧 湖周边洗泥池(.)离湖边外侧 进人池里沉积水(.)离湖边外侧 湖水(.)离湖边外侧 (进人池)湖周边洗泥池(.)湖内 进人池里沉积水(.)湖内 湖水(.)湖内 湖内 期 陈英松等:基于高通量测序对呼伦贝尔陶顺阿尔山细菌群落多样性的研究 .主要试剂与仪器设备胶回收试剂盒(美国)强力土壤 提取试剂盒(美国.)仪(美国应用生物系统公司).方法.提取水体与沉积物总 提取按照相应的提取试剂盒说明书进行操作完成基因组 提取后利用 琼脂糖凝胶电泳检测 的浓度.扩增指定测序区域采用引物:和:扩增细菌 基因 反应条件:、个循环 反应体系:./上引物(/).下引物(/).模板 最后琼脂糖电泳检测 产物利用胶回收试剂盒进行纯化.上机测序利用 二代测序平台对 基因 区测定 该测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成.数据分析 测序得到的序列通过拼接、过滤、去嵌合体、比对得到 条序列序列比对后按照相似性大于 的优化序列划分为一个操作分类单元()生成 表格对 表格进行后续的生物信息统计分析 对得到的 用(:/.)提供的参考序列进行物种分类与注释 将所得结果采用 软件绘制群落结构组分门、属水平图以分析微生物的群落结构、物种组成比例及丰度 利用 软件对各组样本的 多样性指数包括 、覆盖率指数等进行计算并使用 语言工具包制作 和 指数稀释曲线图 计算 多 样 性 距 离 矩 阵 采 用 语 言()软件包进行 分析和作图来比较样品间的物种群落差异 结果与分析.微生物群落在各分类学水平上的数量分布特征陶顺阿尔山共检测到 个细菌门其中沉积物中检测到 个水体中 个水体和沉积物共有的细菌门 个共检测到 个细菌纲其中沉积物中 个水体中 个水体和沉积物共有的细菌纲为 个此外检测到的细菌目、科、属、种的数目分别为、和 个其中沉积物中被检测到的目、科、属、种的数目均多于水体但沉积物和水体中存在大量共有的目、科、属、种陶顺阿尔山微生物在 分类学水平上共检测到 个 其中沉积物中 个水体中 个两者共有 个(表)表 陶顺阿尔山水体和沉积物微生物的分类水平(门到 水平)数目统计 ()类别分 类 水 平 数 目门纲目科属种沉积物 水体共有总计 .微生物多样性指数分析为了准确评估陶顺阿尔山微生物群落的 多样性分别绘制了基于 指数和 多样性指数序列数的稀释曲线(图、图)稀释曲线(图)显示所有样品细菌聚集水平高即将接近饱和阶段这些曲线能较好反映陶顺阿尔山微生物群落多样性从图 中能看出当横坐标值相同时沉积物样品()相比水体样品()有更高的 数表明陶顺阿尔山沉积物样品中微生物群落多样性明显高于水体 稀释曲线(图)也反映了一致的结果当序列超过 条时水体和沉积物样品的 稀释曲线均进入平台期表明继续随测序量增加微生物多样性变化不大测序量充足能够较好反映陶顺阿尔山微生物群落多样性也发现沉积物的 稀释曲线明显比水体高这进一步说明陶顺阿尔山沉积物样品中微生物群落多样性明显高于水体 微 生 物 学 杂 志 卷图 陶顺阿尔山水体与沉积物样品 稀释曲线.图 陶顺阿尔山水体与沉积物样品 稀释曲线.分别对不同采样点样品的微生物多样性指数进行计算得表 基于 指数、指数、指数和 指数发现在沉积物样品中 样品的群落多样性最高 样品的群落多样性最低 在水体样品中 样品的群落多样性最高 样品的群落多样性最低表明微生物群落多样性受到人为因素的影响 结果表明各采样点的覆盖率均在 以上说明各采样地点的微生物物种信息基本得到了充分的体现为了探究不同采样点水体、沉积物细菌的群落组成差异对各个样品进行 多样性分析(图)在水体中因 与、与、与 分别是同一样品不同滤膜富集的样品因此群落组成近乎相似在沉积物中 为离湖边外侧采样表 陶顺阿尔山微生物 多样性指数分析 样品覆盖率/.期 陈英松等:基于高通量测序对呼伦贝尔陶顺阿尔山细菌群落多样性的研究 区因而群落组成较为接近 为湖内采样区群落结构也近乎相似 而 为治疗区与湖内采样区 样品细菌组成最为相似类似的营养条件使得细菌群落结构最为接近 而不同采样点受外界干扰程度不同细菌组成出现较大差异 图 陶顺阿尔山水体与沉积物样品层级聚类树.群落结构分析陶顺阿尔山水体与沉积物中共发现 个优势细菌门(图)相对丰度由高到低依次为变形菌门 、盐厌氧菌门 、拟杆菌门()、脱硫杆菌门()、厚壁菌门().、放线菌门().其中水体()中存在 个优势菌门包括变形菌门、拟杆菌门、盐厌氧菌门、厚壁菌门、脱硫杆菌门、放线菌门等 其中因 和、和、和 为同一样点不同滤膜样品所以群落组成基本一致沉积物()中存图 陶顺阿尔山水体与沉积物样品微生物门水平群落组成.微 生 物 学 杂 志 卷在 个优势菌门包括盐厌氧菌门、变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、脱硫杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门()、未分类菌()、蓝菌门()、绿弯菌门()等菌门 综上水体中最优势菌群为变形菌门(中的丰度最高)而沉积物中最优势菌群为盐厌氧菌门(样品中最高)陶顺阿尔山共发现 个优势菌属(图)相对丰度由高到低依次为嗜盐单胞菌属.、盐厌氧菌属.、冷弯曲菌属()、鞘氨醇单胞菌属().、未分类菌.等其中水体中存在 个优势菌属包括盐单胞菌属、冷弯曲菌属、盐厌氧菌属、海源杆菌()、未 分 类 红 杆 菌()、嗜盐螺旋杆菌()、马里诺杆菌()、未分类菌、热液古柏氏菌()鞘氨醇单胞菌属等 沉积物中存在 个优势菌属包括盐厌氧菌属、盐单胞菌属、未分类菌、鞘氨醇单胞菌属 水体中最优势菌属为盐单胞菌属()而沉积物中最优势菌属为盐厌氧菌属()沉积物与水体群落组成一致但是其丰度有区别 此外水体与沉积物中存在较多未知物种()表明陶顺阿尔山中可能含有未知的新种需要进一步挖掘图 陶顺阿尔山水体与沉积物样品微生物属水平群落组成.水体与沉积物中细菌群落结构比较分析 分析显示水体与沉积物中的细菌群落结构具有显著差别胁强系数 组说明沉积物的微生物类群比水体丰富图 分析图.期 陈英松等:基于高通量测序对呼伦贝尔陶顺阿尔山细菌群落多样性的研究 为了进一步阐明不同样品的物种差异性选取 个共有优势物种通过 秩和检验分布比较水体和沉积物中的差异(图)结果表明水体和沉积物中共有细菌分布明显不同 虽然共有物种在两种类型样品中都占据了相当大的比例但是其相对丰度在水样与沉积物中呈负相关性即在水样中丰度很高在沉积物中却很低嗜盐单胞菌属、海源杆菌、未分类红杆菌科、嗜盐螺旋杆菌()四个菌属在水体中的占比较大而在沉积物中却很少 盐厌氧菌属、鞘氨醇单胞菌属、未分类海洋滑动菌科、未分类的硝化螺旋菌()等其余 个菌属在沉积物中占较大比例在水体中占比很少 这表明物种类群丰度的差异很可能与水体环境和沉积物环境的差异密切相关图 陶顺阿尔山水体与沉积物样品 图.图 陶顺阿尔山水体与沉积物 秩和检验.纵轴表示属分类水平下的物种名物种对应的柱子长度表示该物种在各样本组中的平均相对丰度不同颜色表示不同分组 横轴表示百分比最右边为 值.讨 论大量报道显示变形菌门是低盐环境中的最优势菌门而嗜盐单胞菌属是嗜盐微生物重要的代表菌群在我国青海湖、茶卡盐湖、巴丹吉林沙漠盐碱湖、察尔汗盐湖、印度洛纳尔盐湖等盐碱环境中多被发现 但因不同盐湖环境的地理位置、气候特征及水化学成分不同在群落结构及丰度比例方面存在显著差异 本研究发现的嗜盐菌在门水平分别以变形菌门、盐厌氧菌门为主在属水平分别以嗜盐单胞菌属、盐厌氧菌属为主 微 生 物 学 杂 志 卷陶顺阿尔山位于海拉尔盆地属于中低山丘陵地带有许多丘间洼地草原低地及沙带且大陆性季风气候显著具有日照时间长、昼夜温差大、降水量不足等特点这使得地表水资源不足为盐湖形成及成盐元素的迁移、积累提供有利条件 陶顺阿尔山湖水盐度为./值为 湖水阳离子以、为主阴离子以、为主是陆相盐湖沉积的典型盐碱湖为 嗜 盐 微 生 物 的 生 长 繁 殖 提 供 了 最 佳场所嗜盐单胞菌属作为水体中最优势类群属于变形菌门中 变形菌纲中的一类中度嗜盐菌革兰染色阴性多为细短杆状最适温度为 最适 值为.最适盐浓度为 (质量分数)具有抵抗高盐度的特性 相比在根际土壤、森林、草原等生态系统而言陶顺阿尔山湖水及泥中不仅水分、腐殖酸含量高且盐含量及各种营养物质充分因此其中嗜盐单胞菌属的种类和数量明显较多 嗜盐单胞菌属是一类在盐碱环境中分布广泛且具有多种生物活性的稀有变形菌其产生的四氢嘧啶、甜菜碱、天冬氨酸酶等生物活性物质广泛应用于发酵生产、环境治理、生物制药、医疗等研究领域 盐厌氧菌属作为泥样品中最优势类群在死海、大盐湖、腌制品中被检出 等从鲱鱼中分离出一株盐厌氧菌属的新物种石孔兰从新疆肖库勒盐湖中分离出 株细菌其中一株疑似为盐厌氧菌属的新种 我国大多数盐湖研究中关于分离盐厌菌属的报道鲜少可能是由于这类细菌在长期的进化过程中在生理生化上适应高盐环境的机制不同于其他嗜盐好氧菌分离培养困难所以对其进行的实际应用研究较少本研究发现陶顺阿尔山沉积物中微生物群落多样性与丰富度显著高于水体该结论与其他相近研究结果一致物种类群丰度的差异很可能与水体环境和沉积物环境的差异密切相关可能是由于沉积物中营养物质含量较水体更为丰富生境更稳定更适宜微生物生存 本研究还发现不同采样点间细菌群落结构存在显著差异这不仅与微生物生存环境的营养水平有关其人为因素也是不可忽视的因素之一 此外本研究中陶顺阿尔山水体与沉积物中的未知优势物种占比为 在数据库中并没有其相关记录表明陶顺阿尔山中仍存在大量未知微生物有待于进一步探索发现本研究仅获得了陶顺阿尔山水体和沉积物微生物多样性的信息对真菌和古菌的多样性及环境因素对微生物多样性的影响并未展开调查 但是此次研究通过对陶顺阿尔山水体和沉积物细菌多样性的研究发现了水体和沉积物中含有丰富的细菌类群这对了解与发掘特殊微生物菌种资源具有重要价值同时对保护陶顺阿尔山资源具有潜在的参考意义参考文献:郑喜玉.海拉尔盆地盐湖的形成自然环境.盐湖研究():.于娜许杨阳刘邓等.内蒙古吉布胡郎图诺尔盐湖厌氧菌对白云石形成的催化作用.地球科学():.():.():.孔凡晶王现洁.青藏高原盐湖嗜盐微生物资源及应用前景.科技导报():.().():./:.:.张田田李永臻沈国平等.高盐盐湖可分离嗜盐耐盐菌的种群多样性及四氢嘧啶产量评价.生物技术通报():.楚伦巴特尔.蒙医陶顺阿尔山疗法.中国民间疗法():.邓彩霞模日陈英松等蒙医陶顺阿尔山疗法应用现状调查与分析 以呼伦贝尔市陶顺阿尔山为例.中国民族民间医药():.吴双英李福全.蒙医泥疗“陶顺阿尔山”中无机成分的初步研究.中国民族医药杂志():.袁斌.宜春温泉水体与泉底沉积物细菌多样性分析.基因组学与应用生物学():.龚志婷.云南保山温泉产纤维素酶高温菌多样性研究.应用与环境生物学报 ():.期 陈英松等:基于高通量测序对呼伦贝尔陶顺阿尔山细菌群落多样性的研究 .():.().():.():.():.石晴.青海湖微生物群落的共生模式.中国高原医学与生物学杂志():.李悦.巴丹吉林沙漠盐碱湖沉积物微生物多样性研究.呼和浩特:内蒙古大学.张欣.基于高通量测序研究青藏高原茶卡盐湖微生物多样性.微生物学通报():.沈硕.青藏高原察尔汗盐湖地区可培养中度嗜盐菌的群落结构与多样性.微生物学报():.():.刘建李丹丹杨芳等.一株积聚四氢嘧啶的青海湖盐单胞菌的分离及特性.应用与环境生物学报():.朱德锐.青海湖嗜盐菌的分离与优势菌株 的特性.应用与环境生物学报():.():.().:.石孔兰.嗜盐厌氧细菌的分离、鉴定及其系统发育分析.杭州:浙江大学.:.:.微 生 物 学 杂 志 卷