基于蛋白质组学研究微_纳塑料对巨噬细胞的潜在 影响.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:国家自然科学基金面上项目(22276082);国家自然科学基金面上项目(22176076);云南省科技计划项目(202101BE070001-002);云南省基础研究计划-青年项目(202201AU070157)第一作者:王小霞(1996),女,博士研究生,研究方向为新污染物的健康风险评估,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:#共同通信作者(Co-corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221005001王小霞,官司敏,杨贺然,等.基于蛋白质组学研究微/纳塑料对巨噬细胞的潜在影响J.生态毒理学报,2023,18(3):347-356Wang X X,Guan S M,Yang H R,et al.Potential effects of micro-and nano-plastics on macrophages based on proteomics J.Asian Journal of Ecotoxi-cology,2023,18(3):347-356(in Chinese)基于 蛋 白 质 组 学 研 究 微/纳 塑 料 对 巨 噬 细 胞 的 潜在影响王小霞1,官司敏1,杨贺然1,何欢1,任肖敏1,拾,潘学军1,2,#1.昆明理工大学环境科学与工程学院,昆明 6505002.云南省土壤固碳与污染防治重点实验室,昆明 650500收稿日期:2022-10-05 录用日期:2022-11-19摘要:微塑料作为一种新型环境污染物,其对动物和人体的潜在健康风险受到了广泛的关注。本研究基于蛋白质组学分析研究了 2 种尺寸(3 m 和 75 nm)聚苯乙烯微/纳塑料对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)生物学功能的影响。研究结果表明 3 m 聚苯乙烯微塑料(124)导致差异表达蛋白质的数量相比于 75 nm 聚苯乙烯纳塑料(152)更少。通过对差异表达蛋白质进行 GO(geneontology)功能注释分析,发现 3 m 聚苯乙烯微塑料和75 nm 聚苯乙烯纳塑料都可以对巨噬细胞的生物学过程、细胞组分和分子功能这三大生物学功能产生影响。进一步通过对差异表达蛋白质进行 KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路富集分析,发现 3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料对巨噬细胞炎症反应及调节炎症反应相关的信号通路的影响非常显著。综合以上结果,本研究发现微/纳塑料对巨噬细胞的多个生物学功能具有潜在影响。推测巨噬细胞功能受损可能会影响其在免疫反应中的调节功能,进而导致机体炎症的发生和发展。本研究为微/纳塑料的人体健康潜在危害提供了科学依据和理论基础。关键词:微/纳塑料;巨噬细胞;细胞毒性;蛋白质组学;健康风险文章编号:1673-5897(2023)3-347-10 中图分类号:X171.5 文献标识码:APotential Effects of Micro-and Nano-Plastics on Macrophages Based onProteomicsWang Xiaoxia1,Guan Simin1,Yang Heran1,He Huan1,Ren Xiaomin1,*,Pan Xuejun1,2,#1.Faculty of Environmental Science and Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Carbon Sequestration and Pollution Control in Soils,Kunming 650500,ChinaReceived 5 October 2022 accepted 19 November 2022Abstract:As a new type of environmental pollutants,micro-plastics(MP,100 nm 5 mm)and nano-plastics(NP,100 nm)attract extensive attention for their potential health risks to animals and humans.Numerous studies haveshown that exposure to micro-or nano-plastics decreased the cell viability and damaged the functions of macropha-ges.In this study,the effects of two sizes polystyrene(3 m and 75 nm)on the biological functions of mouse mac-348 生态毒理学报第 18 卷rophages(RAW264.7)were investigated through proteomic analysis.The results showed that the number of differ-entially expressed proteins(DEPs)induced by nano-plastics(152)was more than that of microplastics(124).Thenumber of DEPs induced by micro-plastics and nano-plastics annotated to gene ontology(GO)terms were 39 and54,respectively.By analysis of DEPs though GO terms enrichment,we found that the effects of micro-and nano-plastics on macrophage included biological processes,cellular components and molecular functions.And the DEPswere mainly involved in the interaction between cytokines and their receptors,as well as oxygen carrying activityand other biological processes.Cytokines are key modulators in immune cell regulation of autoimmune response,and immune dysregulation will induce the occurrence and development of chronic inflammation,which may lead toinflammatory diseases.The change of oxygen carrying activity may lead to the change of intracellular reactive oxy-gen species level,thus break the balance of antioxidant system,lead to oxidative stress of macrophages and inflam-matory reaction.These findings suggested that micro-and nano-plastics may affect the biological functions relatedto macrophage inflammatory response.In addition,analysis of DEPs annotated to kyoto encyclopedia of genes andgenomes(KEGG)pathways showed that the micro-and nano-plastics might be interfered with pathways related tometabolism,genetic information processing,environmental information processing,cellular processes,organismalsystems and human diseases.The results of DEPs through KEGG signaling pathways enrichment analysis showedthat the micro-and nano-plastics had significant effects on the signaling pathways related to regulation of inflam-matory response on macrophage.In conclusion,the micro-and nano-plastics had potential effects on multiple bio-logical functions of macrophages and the impaired function of macrophages might affect their regulatory functionin the immune response,and then led to occurrence and development of inflammation in the body.This study pro-vides a scientific basis and theoretical basis for the potential harm of micro-and nano-plastics to human health.Keywords:micro-and nano-plastics;macrophages;cytotoxicity;proteomic analysis;health risks 塑料是人类社会重要的人工合成材料之一,通常是由有机聚合物和一些化学添加剂合成的一种高分子有机材料1,其广泛地应用于我们的日常生活中。从自来水的输送管道到食品饮料的包装材料,都使用了塑料。在这些塑料制品的使用过程中或者废弃后,常规尺寸的塑料材料会因为物理、化学或者生物的作用降解产生微米尺寸的微塑料2,这些微塑料还可能会进一步降解产生纳米尺寸的纳塑料3-5。除了常规尺寸塑料会带来环境污染问题,微/纳塑料也已经成为了一种新污染物,其带来的环境污染和人体健康危害问题也逐渐受到人们的重视。目前已经在多种环境介质(水体6、土壤7、空气8)中都检测到了微/纳塑料的存在。饮食被认为是人体摄入微/纳塑料的主要途径9,在饮用水中10-12、人类日常食用的食物中13-15以及海鲜中3,16都发现了它们的踪迹。值得注意的是,微塑料已经在人类粪便样本中被检测到17-18。这些研究表明微/纳塑料可以被人类摄入。摄入的微/纳塑料会不可避免地与肠道接触,但是其对肠道的毒性效应还不清楚。肠道上皮表面积约 400 m2,是人体最大的黏膜表面19。肠道上皮表面由许多细胞组成,包括分泌黏液的杯状细胞,产生激素的肠内分泌细胞,产生抗菌肽的板状细胞以及协调免疫反应的免疫细胞等20。这些上皮细胞构成了肠腔与内部环境之间的第一道防线21。巨噬细胞是存在于肠道组织中重要的免疫细胞,它以多种方式对进入肠道组织的病原体或外源颗粒物作出反应来协调免疫反应,对于维持肠道组织稳态和调节肠道上皮屏障的完整性具有重要作用22。大量研究表明,刺激巨噬细胞发生不良反应是微/纳米材料普遍的一种生物学效应,如:PM2.523、TiO224和 SiO225。近期,Gu 等26发现微塑料导致成年斑马鱼肠道组织中 M1 型巨噬细胞比例上升,M2 型巨噬细胞比例下降。另外,Hwang 等27报道了微塑料可以增强小鼠巨噬细胞 RAW264.7 潜在的超敏反应。这些研究提示巨噬细胞可能是微/纳塑料在肠道中的作用靶细胞之一,但是目前针对微/纳塑料对巨噬细胞生物学功能影响的研究有限。本研究采用 3 m 和 75 nm 这 2 种尺寸的聚苯乙烯微球分别作为微塑料和纳塑料的模型,采用蛋白组学的方法对微塑料和纳塑料暴露后 RAW264.7细胞内差异表达蛋白质进行分析,进一步通过对差第 3 期王小霞等:基于蛋白质组学研究微/纳塑料对巨噬细胞的潜在影响349 异表达蛋白质进行 GO(gene ontology)和 KEGG(kyoto encyclopedia of gene and genomes)功能注释及功能富集分析,探究 M/NP 对巨噬细胞生物学功能的潜在影响。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 微塑料和纳塑料表征采用透射电镜(TEM,荷兰 FEI 公司,Tecnai G2F30 S-Twin)表征 3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料的形貌特征以及在培养基中的分散状态。样品的水力直径和粒度分布采用马尔文智能激光粒度仪(英国,Mastersizer 3000)进行表征分析。傅里叶变换红外光谱(FTIR,美国赛默飞世尔科技公司,Thermo Scientific Nicolet iS5)分析 3 m 聚苯乙烯微塑料和75 nm 聚苯乙烯纳塑料的组成成分。本研究所使用的聚苯乙烯微塑料和纳塑料均购买于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。1.2 细胞培养与暴露本实 验 使 用 的 细 胞 系 为 小 鼠 巨 噬 细 胞RAW264.7 细胞,该细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海,中国)。RAW264.7 细胞用高糖培养基 DMEM(Gibco,英国)进行常规培养,其中含 10%的胎牛血清(FBS,Gibco),1%的 100 U mL-1青霉素和 100 U mL-1链霉素(中国碧云天生物技术公司)。细胞以每孔10 000 个的密度铺至96 孔板中,之后加入不同浓度的 3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料(浓度分别为 0、1、10、50和 100 g mL-1)置于 37、5%CO2和 95%空气的加湿培养箱中培养 24 h。1.3 细胞活力检测3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料对 RAW264.7 细胞活力的影响采用购自美仑生物技术有限公司(大连,中国)的 CCK-8 试剂盒进行评估。细胞以每孔 8 000 个的密度铺至 96 孔板中,之后加入 3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料。暴露结束后,每孔加入 10 L 的 CCK-8 试剂继续孵育 4 h,采用酶标仪(美国 SpectraMax Ms 公司,Molecular Devices)在 450 nm 波长下测定吸光度值,用 630 nm 波长下的吸光度值扣除背景。1.4 蛋白组测序及生物信息学分析3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料对 RAW264.7 细胞暴露处理 24 h 后,用 PBS 洗 3次以充分去除颗粒物和培养液,使用购买于碧云天生物技术公司的试剂提取总蛋白。取蛋白样品 100g 进行酶解烷基化以及标记,之后用反相 C18 柱进行高 pH 液 相 分 离。采 用 Tandem Mass Tags(TMT)技术对蛋白质进行定量,定量结果采用 Pro-teome Discoverer TM Software 2.2 进行分析。使用R 语言中的 t.test 函数计算样本间差异显著性P值,同时计算组间差异倍数(fold change,FC),显著?差异表达蛋白的筛选标准如下:P1.2?为上调蛋白,P0.05 且 FC0.83 为下调蛋白。选择?GO(http:/geneontology.org/)对所有的差异蛋白进行功能聚类分析,采用 KEGG(http:/www.genome.jp/kegg/)通路数据库对差异蛋白质涉及的代谢通路进行分析。采用美吉生物云平台()对蛋白质组学测序的数据进行分析。通过 PCA(Principal Component Analysis)分析发现同组的 3 个样本距离很近,表明样本间的相似性较高(图 S2)。3m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料暴露组在 PC2 的方向与对照组样本分离,75 nm 聚苯乙烯纳塑料暴露组在 PC1 的方向与 PS-MP 暴露分离,表明 3 组样本之间存在非常有效的区别。1.5 统计分析本研究所有实验进行 3 次重复,以独立实验的平均值+SD 表示。组间的统计学差异采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析。*代表P0.05?被认为具有统计学意义,使用 GraphPad prism 9.0 软件进行统计分析。2 结果(Results)2.1 微/纳塑料的形貌特征采用 TEM 表征发现 3 m 聚苯乙烯微塑料和75 nm 聚苯乙烯纳塑料均呈圆球形状,在溶液中没有明显的聚集现象。3 m 聚苯乙烯微塑料和 75nm 聚苯乙烯纳塑料的平均粒径分别是(3.00.5)m和(74.280.26)nm。FTIR 分析表明 2 种聚苯乙烯微/纳塑料的特征峰出现在相同的位置。TEM、马尔文激光粒度仪和 FTIR 的表征结果表明本研究所使用的微塑料和纳塑料只有粒径不同,材料的形貌和组成成分均相同。2.2 微/纳塑料对 RAW264.7 细胞的细胞毒性通过 CCK-8 法测定 3 m 聚苯乙烯微塑料和75 nm 聚苯乙烯纳塑料对 RAW264.7 细胞的细胞毒性效应。如图 2 所示,CCK-8 的检测结果表明 2 种微/纳塑料均以剂量依赖的方式导致 RAW264.7 的细胞活力下降,其最低有效浓度为 1 gmL-1。通过比较相同浓度(10、50 和 100 gmL-1)微/纳塑料350 生态毒理学报第 18 卷对细胞活力和活细胞百分比的影响,发现 75 nm 聚苯乙烯纳塑料比 3 m 聚苯乙烯微塑料表现出更强的细胞毒性(图 1)。基于以上结果,发现 3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料对 RAW264.7细胞都具有细胞毒性,且 75 nm 聚苯乙烯纳塑料的细胞毒性作用强于 3 m 聚苯乙烯微塑料。2.3 蛋白质组学研究微/纳塑料对 RAW264.7 细胞蛋白质表达的影响 为了探究 3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料对 RAW264.7 细胞生物学功能的影响,首先采用蛋白质组学分析了 2 种尺寸的微/纳塑料对巨噬细胞蛋白质表达的影响。如图 2(a)所示,与对照组相比,3 m 聚苯乙烯微塑料下调和上调的蛋白质数量分别为74 和50。如图2(b)所示,与对照组相比,75 nm 聚苯乙烯纳塑料下调和上调的蛋白质数量分别为 86 和 66。以上结果表明 75 nm 聚苯乙烯纳塑料诱导 RAW264.7 细胞蛋白质发生差异表达的数量较 3 m 聚苯乙烯微塑料多。因此,通过 Venn 分析鉴定了 3 m 聚苯乙烯微塑料和75 nm 聚苯乙烯纳塑料分别上调和下调蛋白集中蛋白质的重叠关系。如图 3(a)所示,3 m 聚苯乙烯微塑料下调的特有蛋白质有 31 个,75 nm 聚苯乙烯纳塑料下调的特有蛋白质有 43 个,3 m 聚苯乙烯微塑料和75 nm 聚苯乙烯纳塑料下调的共有蛋白质43 个。由图3(b)可知,3 m 聚苯乙烯微塑料上调的特有蛋白质有 30 个,75 nm 聚苯乙烯纳塑料上调的特有蛋白质有46 个,3 m 聚苯乙烯微塑料和 75nm 聚苯乙烯纳塑料上调的共有蛋白质有20 个。2.4 差异表达蛋白的 GO 功能注释分类及富集分析 进一步对差异表达蛋白集中的蛋白质进行了GO 功能注释分析并进行分类统计,探究 3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料对 RAW264.7细胞生物学功能的潜在影响。GO 功能注释分析发现,3 m 聚苯乙烯微塑料诱导的差异表达蛋白质在参与生物学过程、细胞组分以及分子功能的条目数分别是 23、4 和 12 个。75 nm 聚苯乙烯纳塑料诱导的差异表达蛋白质在参与这三大生物学功能的条目数分别是 35、4 和 15 个。还进一步对 GO 功能注释进行了富集分析,筛选出了微塑料和纳塑料诱导差异表达蛋白质参与的最显著的前 20 个生物学功能。如图 4(a)所示,3 m 聚苯乙烯微塑料导致三大生物学功能变化最显著的前 20 个条目包括:7 个生物学过程、10 个细胞组分和 3 个分子功能。75 nm 聚苯乙烯纳塑料导致三大生物学功能变化最显著的前20 个条目包括:8 个生物学过程、5 个细胞组分以及7 个分子功能(图 4(b)。以上这些结果表明 3 m 聚苯乙烯微塑料和75 nm 聚苯乙烯纳塑料对 RAW264.7细胞的三大生物学功能都有影响。2.5 差异表达蛋白的 KEGG 通路功能注释分类及富集分析 在本研究中,还对差异蛋白集进行 KEGG 通路功能注释的分类统计。差异表达蛋白质注释到的通图 1 采用 CCK-8 法检测 3 m 聚苯乙烯微塑料(PS-MP)和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料(PS-NP)对 RAW264.7 细胞的细胞毒性注:该结果为 3 组独立实验的均值+SD;*代表对应组与对照组相比P0.05。Fig.1 Cytotoxic effects of 3 m polystyrene microplastics(PS-MP)and 75 nm polystyrene nanoplastics(PS-MP)in RAW264.7 cellsNote:The results shown here are obtained from three independent experiments and are presented as the meansSD;*P分子功能细胞组分。进一步通过 GO 富集分析,发现 PS-M/NP 诱导差异表达的蛋白质主要参与细胞因子及其受体的相互作用以及载氧活性等生物学过程。细胞因子及其受体的相互作用被干扰可能会导致细胞因子的异常分泌,细胞因子是免疫细胞调节自身免疫反应中的关键调节剂,免疫失调会诱导慢性炎症的发生和发展,进而可能会导致炎症性疾病28-30。载氧活性发生改变可能会导致细胞内活性氧水平过度升高从而打破抗氧化系统的平衡,这会诱导巨噬细胞发生氧化应激31。氧化应激可能会诱导巨噬细胞发生凋亡,大量的细胞死亡往往伴随着机体组织损伤,组织的局部损伤有导致炎症的风险。同时,巨噬细胞内活性氧水平的过度升高可能会导致慢性炎症的发生进而导致炎症性疾病。这部分研究结果提示微/纳塑料可能会影响巨噬细胞炎症反应相关的生物功能。另外,通过对差异表达蛋白质进行 KEGG 富集分析,发现 3 m 聚苯乙烯微塑料和 75 nm 聚苯乙烯纳塑料暴露与炎症性肠病、MAPK 以及免疫相关疾病的信号通路有关。MAPK 通路有三级的信号传递过程:MAPK,MAPK 激酶(MEK 或 MKK)以及 MAPK激酶的激酶(MEKK 或 MKKK)。这3 种激酶能依次激活,共同调节着细胞的生长、分化、应激、炎症反应等多种重要的生理/病理效应。MAPK 通路既参与调控细胞内活性氧的水平也参与调控炎症反应,活性氧、炎症与免疫之间有着密不可分的联系30,32-35。因此,MAPK 通路的正常激活被干扰,巨噬细胞自身的生长分化都会受到影响甚至可能会导致巨噬细胞对活性氧的应激反应以及对炎症的调控作用失常。KEGG 富集分析的结果同样表明微/纳塑料可能会影响巨噬细胞炎症反应相关的生物功能。综合GO 富集分析和 KEGG 富集分析的结果,发现微/纳塑料可能会对巨噬细胞的多个生物学功能产生影响,其中最需要受到关注的是炎症反应相关的功能。微/纳塑料可能通过干扰巨噬细胞中炎症信号通路的激活促进炎症相关的疾病的发展,也可能会通过干扰巨噬细胞自身功能的异常发挥干扰其在免疫反应中的调节作用,最终可能会通过连锁反应损害其在机体中的免疫调节功能。微/纳塑料对巨噬细胞的毒理学机制可能是复杂的,不同尺寸的颗粒,其毒理学机制也可能存在差异。因此,未来需要对这些机制以及不同尺度颗粒诱导毒性的作用机制之间的差异进行系统的研究。这项研究可为微/纳塑料暴露对人体免疫细胞的风险评估提供科学依据,对明确摄入微/纳塑料的潜在危害具有比较重要的意义。通信作者简介:任肖敏(1986),女,博士,教授,主要研究方向为新污染物对人体健康潜在的影响。共同通信作者简介:潘学军(1970),男,博士,教授,主要研究方向为新污染物的化学行为和生态毒理学。参考文献(References):1 Suaria G,Avio C G,Mineo A,et al.The MediterraneanPlastic Soup:Synthetic polymers in Mediterranean surfacewaters J.Scientific Reports,2016,6:375512 Thompson R C,Olsen Y,Mitchell R P,et al.Lost at sea:Where is all the plastic?J.Science,2004,304(5672):8383 Auta H S,Emenike C U,Fauziah S H.Distribution andimportance of microplastics in the marine environment:Areview of the sources,fate,effects,and potential solutionsJ.Environment International,2017,102:165-1764 Lambert S,Wagner M.Characterisation of nanoplasticsduring the degradation of polystyrene J.Chemosphere,2016,145:265-2685 Alimi O S,Farner Budarz J,Hernandez L M,et al.Mi-croplastics and nanoplastics in aquatic environments:Ag-gregation,deposition,and enhanced contaminant transportJ.Environmental Science&Technology,2018,52(4):1704-17246 Zhang K,Shi H H,Peng J P,et al.Microplastic pollutionin Chinas inland water systems:A review of findings,methods,characteristics,effects,and management J.Science of the Total Environment,2018,630:1641-16537 Zhang G S,Liu Y F.The distribution of microplastics insoil aggregate fractions in southwestern China J.Scienceof the Total Environment,2018,642:12-208 Chu J H,Liu H M,Salvo A.Air pollution as a determi-nant of food delivery and related plastic waste J.NatureHuman Behaviour,2021,5(2):212-2209 Rahman A,Sarkar A,Yadav O P,et al.Potential humanhealth risks due to environmental exposure to nano-andmicroplastics and knowledge gaps:A scoping review J.第 3 期王小霞等:基于蛋白质组学研究微/纳塑料对巨噬细胞的潜在影响355 Science of the Total Environment,2021,757:14387210 Zhang Q,Xu E G,Li J N,et al.A review of microplasticsin table salt,drinking water,and air:Direct human expo-sure J.Environmental Science&Technology,2020,54(7):3740-375111Ranjan V P,Joseph A,Goel S.Microplastics and otherharmful substances released from disposable paper cupsinto hot water J.Journal of Hazardous Materials,2021,404:12411812Zuccarello P,Ferrante M,Cristaldi A,et al.Exposure tomicroplastics(10 m)associated to plastic bottles min-eral water consumption:The first quantitative study J.Water Research,2019,157:365-37113 Fadare O O,Wan B,Guo L H,et al.Microplastics fromconsumer plastic food containers:Are we consuming it?J.Chemosphere,2020,253:12678714 Yang D Q,Shi H H,Li L,et al.Microplastic pollution intable salts from China J.Environmental Science&Technology,2015,49(22):13622-1362715 Liebezeit G,Liebezeit E.Non-pollen particulates in honeyand sugar J.Food Additives&Contaminants Part A,Chemistry,Analysis,Control,Exposure&Risk Assess-ment,2013,30(12):2136-214016 Catarino A I,Macchia V,Sanderson W G,et al.Low lev-els of microplastics(MP)in wild mussels indicate thatMP ingestion by humans is minimal compared to expo-sure via household fibres fallout during a meal J.Envi-ronmental Pollution,2018,237:675-68417Schwabl P,Kppel S,Knigshofer P,et al.Detection ofvarious microplastics in human stool:A prospective caseseries J.Annals of Internal Medicine,2019,171(7):453-45718 Yan Z H,Liu Y F,Zhang T,et al.Analysis of microplas-tics in human feces reveals a correlation between fecalmicroplastics and inflammatory bowel disease status J.Environmental Science&Technology,2022,56(1):414-42119 Peterson L W,Artis D.Intestinal epithelial cells:Regula-tors of barrier function and immune homeostasis J.Na-ture Reviews Immunology,2014,14(3):141-15320 Gerbe F,Legraverend C,Jay P.The intestinal epitheliumtuft cells:Specification and function J.Cellular and Mo-lecular Life Sciences,2012,69(17):2907-291721 Ulluwishewa D,Anderson R C,McNabb W C,et al.Reg-ulation of tight junction permeability by intestinal bacteriaand dietary components J.The Journal of Nutrition,2011,141(5):769-77622 Zhang S Z,Zhao X H,Zhang D C.Retraction Note:Cel-lular and molecular immunopathogenesis of ulcerative co-litis J.Cellular&Molecular Immunology,2014,11(3):31423 Cao X Q,Han Y H,Gu M,et al.Foodborne titanium di-oxide nanoparticles induce stronger adverse effects inobese mice than non-obese mice:Gut microbiota dysbio-sis,colonic inflammation,and proteome alterations J.Small,2020,16(36):e200185824 Moon K S,Bae J M,Oh S.The diameter effect of TiO2nanotube on inflammatory response in Raw 264.7 macro-phages J.Korean Journal of Dental Materials,2013,40(1):25-3225Tsugita M,Morimoto N,Nakayama M.SiO2and TiO2nanoparticles synergistically trigger macrophage inflam-matory responses J.Particle and Fibre Toxicology,2017,14(1):1126 Gu W Q,Liu S,Chen L,et al.Single-cell RNA sequen-cing reveals size-dependent effects of poly